【摘要】：背景和目的:食管鱗癌是我國特色的惡性消化道腫瘤,拷貝數(shù)變異是其主要的基因組改變類型。我們前期通過對94對食管鱗癌組織及其配對血液樣本的全基因組測序數(shù)據(jù)分析,鑒定出23個拷貝數(shù)擴增區(qū)段,包含1591個拷貝數(shù)擴增基因。通過對基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析,我們發(fā)現(xiàn)其中有149個拷貝數(shù)擴增的基因在腫瘤組織中異常高表達(dá),提示這些基因可能在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究旨在通過高通量功能篩選尋找具有功能的拷貝數(shù)擴增基因,研究其在食管鱗癌進展中的作用機制,為食管鱗癌提供潛在的治療靶點。方法:運用高通量功能篩選方法結(jié)合siRNA文庫對149個候選基因進行功能篩選。采用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析、免疫印跡以及免疫組化的方法,從mRNA水平和蛋白水平上檢測目的基因在食管鱗癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)情況。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)以及慢病毒感染方法在食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30和KYSE150中將目的基因敲除或過表達(dá),在體內(nèi)外分析擾動其表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的作用。通過細(xì)胞活力檢測、克隆形成、ATP水平檢測、免疫印跡等細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)以及分子生物學(xué)實驗,探究拷貝數(shù)變異基因影響腫瘤增殖的作用機制。用IC50評估擾動目的基因后細(xì)胞對化療藥物敏感性的改變。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)TIGAR是149個候選基因中對腫瘤細(xì)胞增殖影響最顯著的基因,過表達(dá)TIGAR促進食管癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖。TIGAR高表達(dá)抑制糖酵解途徑,但促進旁通路磷酸戊糖途徑,從而產(chǎn)生大量5-磷酸-核糖和NADPH,降低食管鱗癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。TIGAR高表達(dá)通過激活p-AMPK促進谷氨酰胺代謝途徑為細(xì)胞增殖提供能量,使細(xì)胞高度依賴谷氨酰胺代謝并對谷氨酰胺酶抑制劑敏感性升高。抑制谷氨酰胺代謝或AMPK可消除TIGAR高表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。谷氨酰胺剝奪或谷氨酰胺酶抑制劑與5-氟尿嘧啶具有協(xié)同效應(yīng),可有效抑制TIGAR擴增或過表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞的增殖。結(jié)論:TIGAR拷貝數(shù)擴增和高表達(dá)促進磷酸戊糖途徑和谷氨酰胺代謝途徑,進而促進食管鱗癌細(xì)胞增殖。TIGAR高表達(dá)降低食管鱗癌細(xì)胞對化療藥5-氟尿嘧啶的敏感性,而聯(lián)合使用谷氨酰胺酶抑制劑可有效抑制TIGAR過表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞的增殖,提示TIGAR可能是食管鱗癌個體化治療的標(biāo)志物。
【圖文】：

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院巾國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博N學(xué)位論義邐結(jié)果逡逑結(jié)果逡逑一、食管鱗癌中１４９個拷貝數(shù)擴增基因的篩選逡逑通過對９４對食管鱗癌患者的癌組織和配對的血液組織或近端癌旁組織進行全逡逑基因組測序以及轉(zhuǎn)錄組測序，繪制食管癌突變譜以及表達(dá)譜。通過全基因組測序檢逡逑測基因拷貝數(shù)量，繼而通過環(huán)形二元分割法將全基因組原始數(shù)據(jù)分成有相同數(shù)量的逡逑拷貝數(shù)區(qū)域，通過ＧＩＳＴＩＣ２．０計算得到２３個拷貝數(shù)擴增區(qū)域，，包含１５９１個基因。逡逑使用Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ軟件對轉(zhuǎn)錄本進行組裝并計算基因ｍＲＮＡ表達(dá)水平。通過秩相關(guān)分逡逑析檢測ＤＮＡ水平拷貝數(shù)改變與ｍＲＮＡ水平表達(dá)改變的相關(guān)性，尋找隨著拷貝數(shù)擴逡逑增ｍＲＮＡ表達(dá)升高的基因（拷貝數(shù)變異與基因表達(dá)改變一致，Ｐ＜０．０５，ｒ＞０．３５），逡逑得到４２１個基因。進一步通過轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析篩選癌與癌旁差異表達(dá)基因（尸＜０．０５，逡逑ＦＣ２邋１．３），共得到１４９個候選進入后續(xù)的功能篩選階段（表１，圖１）。逡逑

圖３人類常見腫瘤中７７Ｇ／１／？拷貝數(shù)變異逡逑在癌癥基因組數(shù)據(jù)庫邋ｃＢｉｏ邋Ｃａｎｃｅｒ邋Ｇｅｎｏｍｉｃｓ邋Ｐｏｒｔａｌ邋（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／）分析邋７７Ｇｄ尺基逡逑因在常見腫瘤中的拷貝數(shù)變化情況。圖中結(jié)果表明基因在２０個腫瘤基因組的研究中均逡逑存在拷貝數(shù)擴增。柱形圖表示Ｊ７（Ｌ４ｉ？的拷貝數(shù)變異頻率。其中藍(lán)色表示拷貝數(shù)缺失，紅色表逡逑示拷貝數(shù)擴增。逡逑另外，我們利用ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫中其余鱗癌的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果表明７Ｘ４Ｇｉ？在逡逑其余三種淲狀細(xì)胞癌（宮頸鱗癌、頭頸部淲癌、肺鱗癌）中拷貝數(shù)與ｍＲＮＡ的表達(dá)逡逑均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（宮頸鱗癌：ｒ＝邋０．３９，尸＜邋０．００１，頭頸部淲癌：ｒ邋＝邋０．３３，尸＜逡逑０．００１；肺淲癌：ｒ邋＝邋０．４６，尸＜０．００１；圖邋５Ａ）。７７（２４７？的拷貝數(shù)取邋ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ邋數(shù)值后逡逑總體趨勢上與ｍＲＮＡ水平改變一致（圖５Ｂ）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

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本文編號：2639895