【摘要】：結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤,在中國(guó)是癌癥相關(guān)性死亡的第三大原因~([1])。結(jié)直腸癌的預(yù)后與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的程度直接相關(guān)。盡管目前在早期診斷、根治性手術(shù)、放療和新輔助化療等幾個(gè)方面對(duì)結(jié)直腸癌的治療取得了可觀的進(jìn)展,但仍然沒有令人滿意的治療方法,而且結(jié)腸癌患者的死亡由于患者的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而有所增加~([2])。對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和早期腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷和預(yù)防至關(guān)重要,因此有必要探索新型分子標(biāo)志物對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后的作用。但迄今為止,結(jié)直腸癌發(fā)生、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移潛在的調(diào)控機(jī)制尚不清楚,很少有新的預(yù)后生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)和鑒定。轉(zhuǎn)錄因子HNF 3β(肝細(xì)胞核因子3β)又稱FOXA2(forkhead box A2),屬于肝細(xì)胞核因子(HNF)家族。由HNF1,HNF3,HNF4,HNF6和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CEBPs)組成的肝細(xì)胞核因子(HNF)家族在發(fā)育中起關(guān)鍵作用~([3])。之前有研究表明,HNF3轉(zhuǎn)錄因子,特別是HNF3α/FOXA1,HNF3β/FOXA2和HNF3γ/FOXA3在胃腸道分化中起重要作用~([4])。HNF3βmRNA在胚胎發(fā)生時(shí)首先表達(dá),并在前原條和節(jié)間的原腸期中觀察到,隨后在腸中表達(dá)~([5-7])。由于會(huì)導(dǎo)致節(jié)點(diǎn)和脊索發(fā)育失敗,HNF3β缺陷可導(dǎo)致胚胎死亡~([8])。它不僅在胚胎發(fā)育(包括節(jié)點(diǎn),神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)胚層衍生結(jié)構(gòu)的形成)中起著關(guān)鍵作用,還通過調(diào)節(jié)正常膽汁酸和脂質(zhì)體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)出生后發(fā)育~([9])。許多研究表明,HNF3β低表達(dá)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),這在幾種腫瘤包括肝細(xì)胞癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和甲狀腺癌中都有報(bào)道~([10-14])。然而,HNF3β在結(jié)直腸癌中的作用尚未見有研究,HNF3β在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用仍不明確。在本研究中,我們分析了HNF3β在174例結(jié)腸癌患者中的表達(dá)水平及其對(duì)患者的預(yù)后作用以及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)功能的影響。第一部分HNF3β在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義研究目的:研究結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中HNF3β的表達(dá)情況,分析其表達(dá)與患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系,并研究其對(duì)患者預(yù)后的影響。研究方法:取8例結(jié)直腸炎癥組織、14例結(jié)直腸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、18例結(jié)直腸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、174例結(jié)直腸腫瘤切除標(biāo)本和3例正常結(jié)直腸組織,通過免疫組化染色方法檢測(cè)HNF3β蛋白在各組織中的表達(dá)情況。以上所有組織標(biāo)本均來源于海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院長(zhǎng)征醫(yī)院普通外科在2010年10月-2011年9月收治采集的患者標(biāo)本。這些患者在術(shù)前均未接受新輔助化療或放療,術(shù)后II期、III期和IV期患者按Xelox化療方案(奧沙利鉑和卡培他濱)進(jìn)行化療。通過從患者的電子病歷中搜集和電話隨訪的方法整理出病人的臨床資料和隨訪數(shù)據(jù),采用Yates校正或Fisher精確概率法卡方(?2)檢驗(yàn)分析和Spearman等級(jí)相關(guān)分析將HNF3β與患者臨床數(shù)據(jù)之間進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;Kaplan-Meier法繪制結(jié)直腸癌病人的生存曲線,Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多變量分析,評(píng)價(jià)各個(gè)指標(biāo)是否為患者的預(yù)后獨(dú)立因素。結(jié)果:HNF3β蛋白在3例正常結(jié)直腸上皮組織、8例結(jié)腸直腸炎癥組織、14例結(jié)直腸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織和18例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中高表達(dá),在174例結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)。在174例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中,56%的標(biāo)本為低表達(dá)“+”或不表達(dá)“-”。并且統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn),HNF3β在結(jié)直腸癌和非癌性組織中的染色差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P小于0.0001。由此證明HNF3β在結(jié)直腸癌中低表達(dá)或不表達(dá)。HNF3β低表達(dá)與結(jié)直腸癌UICC臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有無和患者預(yù)后密切相關(guān)(P0.05),而與患者年齡、性別、組織學(xué)分型、腫瘤分化程度、腫瘤所在部位無關(guān)(P0.05)。單變量分析顯示HNF3β低表達(dá)和UICC臨床分期、侵襲程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否一樣,都與患者預(yù)后密切相關(guān)(P0.001)。用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多變量分析,結(jié)果顯示:HNF3β低表達(dá)(HR:0.601,95%CI:0.387-0.933,P=0.023),遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(HR:5.890,95%CI:1.028-33.772,P=0.046)和UICC臨床分期(HR:3.737,95%CI:1.611-8.668,P=0.002)都是患者總體生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,而HNF3β低表達(dá)(HR:0.606,95%CI:0.392-0.937,P=0.024),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR:0.171,95%CI:0.032-0.899,P=0.037)和UICC臨床分期(HR:9.935,95%CI:2.214-44.574,P=0.003)是患者無進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。結(jié)論:從蛋白質(zhì)水平證實(shí)HNF3β在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)或不表達(dá),而在正常結(jié)直腸上皮組織、結(jié)直腸炎癥組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變等非癌組織中高表達(dá)。HNF3β的表達(dá)與結(jié)直腸癌UICC臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)(P0.05),低表達(dá)HNF3β的結(jié)直腸癌患者有著極差生存期,HNF3β蛋白的表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。第二部分HNF3β對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞系增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其可能機(jī)制研究目的:研究HNF3β對(duì)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,并觀察小鼠體外成瘤HNF3β對(duì)瘤體重量的影響,并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。研究方法:構(gòu)建HNF3β慢病毒和空載病毒,分別轉(zhuǎn)染sw480細(xì)胞,建立HNF3β過表達(dá)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株及空載病毒SW480細(xì)胞株,利用蛋白印跡法(western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HNF3β的表達(dá)情況,從蛋白水平證實(shí)細(xì)胞模型構(gòu)建成功。通過MTT法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HNF3β過表達(dá)后細(xì)胞增殖能力的變化,通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究HNF3β過表達(dá)后細(xì)胞遷移能力的變化。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在動(dòng)物體內(nèi)HNF3β過表達(dá)后對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤生長(zhǎng)的影響。建立HNF3β過表達(dá)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株及空載病毒SW480細(xì)胞株,利用蛋白印跡法(western blot)檢測(cè)JAK/STA信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白:IL6,JAK1和STAT3的表達(dá)情況。結(jié)果:與載體病毒SW480細(xì)胞系和正常SW480細(xì)胞株相比,SW480細(xì)胞株過表達(dá)HNF3β的細(xì)胞增殖明顯減少,尤其是在第4,5,6天時(shí)(P0.05)。結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖,侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中也有類似現(xiàn)象(P0.05)。結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞系在裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)顯示,過表達(dá)組腫瘤重量顯著低于正常組和負(fù)荷病毒組(P0.05)。在體外結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞HNF3β過表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)JAK/STA信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白:IL6、JAK1和STAT3表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:HNF3β的低表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移特性有關(guān),體內(nèi)裸鼠移植瘤模型也證實(shí)過表達(dá)HNF3β裸鼠的瘤體更輕,這提示HNF3β可能為結(jié)直腸癌的一個(gè)抑癌基因。HNF3β可能通過JAK/STA信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,提示HNF3β可能是結(jié)直腸癌的一個(gè)抑癌基因,但對(duì)其機(jī)制以及上下游通路需進(jìn)一步探討。
【圖文】：

1、HNF3β 在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸上皮組織、結(jié)腸直腸炎癥組織、低級(jí)別上皮織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織等非癌組織中的表達(dá)情況，其中 A：a（正常結(jié)直腸織）、b（結(jié)腸直腸炎癥組織）、c（結(jié)直腸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織）、d（結(jié)直別上皮內(nèi)瘤變組織）、e（結(jié)直腸腺癌組織）、f（結(jié)直腸粘液腺癌組織）（×2二、HNF3β 蛋白與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系HNF3β 的表達(dá)與患者 UICC 臨床分期、腫瘤浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、有無遠(yuǎn)患者預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、組織學(xué)分型、分化程度及無關(guān)（P＞0.05），即臨床分期越晚、腫瘤浸潤(rùn)程度越深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有及預(yù)后不良的患者組織中 HNF3β 的表達(dá)越低。由此提示 HNF3β 可能與結(jié)直腸發(fā)展有關(guān)聯(lián)，即 HNF3β 表達(dá)越低，結(jié)直腸癌惡性程度可能越高。

置入-80℃冰箱 24 小時(shí)后，移入液氮保存。HNF3β 過表達(dá) SW480 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建F3β 慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 hnf3b-HA-3Flag-P2A-LUC-F2A-Puro 委托上海和元生物公司譜見圖 3。表五、重組質(zhì)粒 hnf3b-HA-3Flag-P2A-LUC-F2A-Puro 基本信息nk ID NM_153675 基因大小 1Human 上下游克隆酶切位點(diǎn) E稱 H116 Amp 抗性元件 hnf3b-HA-3Flag-P2A-LUC-F2A-Puro序引物 CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG序引物 GLP2 CTTTATGTTTTTGGCGTCCTTCCA
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.34

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2640043