【摘要】：背景與目的食管癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道腫瘤之一,患者早期無(wú)明顯癥狀或癥狀十分輕微,待出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難后就診,常常已發(fā)展到中晚期,失去了手術(shù)治療的最好時(shí)機(jī),目前聯(lián)合化療是晚期食管癌患者的首選治療方案。順鉑是臨床上應(yīng)用最廣泛的化療藥物之一,但是,許多患者在順鉑治療過(guò)程中出現(xiàn)了化療抵抗,影響治療效果。DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)屬于DNA聚合酶中的一員,是堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)中的關(guān)鍵酶,可填補(bǔ)DNA堿基損傷切除產(chǎn)生的單核苷酸缺口,對(duì)于基因組穩(wěn)定性的維持至關(guān)重要。polβ的異常高表達(dá)和突變體可引起B(yǎng)ER異常、自發(fā)突變率增加、基因組不穩(wěn)定和染色體畸變等,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)約18-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,在許多生物體內(nèi)均有表達(dá),并且高度保守。不同的miRNA在同一細(xì)胞中的調(diào)控作用不同,靶標(biāo)分子可能不同,并且同一 miRNA在不同細(xì)胞中的靶標(biāo)分子也可能不同,調(diào)控作用也不盡相同。由于miRNAs可調(diào)控包括腫瘤相關(guān)基因在內(nèi)的大量基因,因此miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療預(yù)后有著密切關(guān)系。本課題組前期通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn),polβ可能是miR-499的靶基因。前期基因芯片分析結(jié)果顯示,食管癌患者癌組織中miR-499的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,并且化療不敏感食管癌患者癌組織中miR-499的表達(dá)水平顯著低于化療敏感組織。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的具有完整隨訪記錄、組織中polβ已進(jìn)行過(guò)測(cè)序的538例食管癌患者資料進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)177-234 nt缺失型polβ的食管癌患者化療抵抗,生存期較短。本研究旨在探索miR-499對(duì)食管癌細(xì)胞化療敏感性的影響及其作用機(jī)制;明晰177-234nt缺失型polβ對(duì)食管癌細(xì)胞化療敏感性作用及其機(jī)制。本研究共分為以下兩部分。第一部分miR-499靶向調(diào)控polβ對(duì)食管癌細(xì)胞化療敏感性的影響方法1.采用qRT-PCR和Western blot方法檢測(cè)538例食管癌患者癌組織及其癌旁組織中的polβ和miR-499表達(dá)水平;分析食管癌患者癌組織中polβ表達(dá)量與miR-499表達(dá)量的相關(guān)性。2.建立穩(wěn)定表達(dá)miR-499的EC9706和KYSE30細(xì)胞株,采用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光和彗星實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)miR-499對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706的KYSE30化療敏感性的影響。3.建立穩(wěn)定表達(dá)miR-499的EC9706-Luc細(xì)胞株,接種到裸鼠右側(cè)腋下。在裸鼠腹腔內(nèi)按照每千克裸鼠體重3 mg順鉑注射順鉑生理鹽水溶液,三天一次,共9次。接種后每7天進(jìn)行1次裸鼠移植瘤活體成像,觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況。4.利用生物信息學(xué)軟件分析miR-499的靶基因;構(gòu)建polβ3'UTR野生型和突變型報(bào)告載體,與miR-499 mimic/negative control共轉(zhuǎn)入食管癌細(xì)胞EC9706和KYSE30中,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證polβ是否是miR-499的靶基因。5.構(gòu)建無(wú)polβ 3'UTR的重組表達(dá)載體pcDNA3.1-polβ,轉(zhuǎn)入穩(wěn)定表達(dá)miR-499的EC9706和KYSE30細(xì)胞株,采用MTT和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)無(wú)3'UTR的polβ對(duì)miR-499對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706的KYSE30化療敏感性影響的回復(fù)作用。結(jié)果1.食管癌患者癌組織中miR-499的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);食管癌患者癌組織中polβ mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);相關(guān)性分析結(jié)果顯示,食管癌患者癌組織中miR-499與polβ表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。2.細(xì)胞學(xué)行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC和Blank組相比,miR-499可增強(qiáng)順鉑對(duì)EC9706和KYSE30細(xì)胞的增殖抑制、凋亡促進(jìn)作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.裸鼠移植瘤活體成像結(jié)果顯示,miR-499組裸鼠移植瘤處的絕對(duì)光子數(shù)自第14天明顯低于NC和Blank組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,polβ 3'UTR區(qū)包含可與miR-499互補(bǔ)結(jié)合的序列,polβ可能是miR-499的作用靶點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染miR-499 mimic和polβ 3'UTR野生型重組載體的細(xì)胞中螢光素酶活性明顯低于共轉(zhuǎn)染miR-499 mimic和polβ 3'UTR突變型重組載體,和轉(zhuǎn)染miR-499 negative control時(shí)的細(xì)胞(P0.05)。5.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-polβ的miR-499組細(xì)胞的IC50較單獨(dú)miR-499組明顯升高(P0.05),凋亡細(xì)胞數(shù)百分比較單獨(dú)miR-499組明顯降低(P0.05),無(wú)3'UTR的polβ可回復(fù)miR-499對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706和KYSE30化療敏感性的影響。第二部分177-234 nt缺失型polβ對(duì)食管癌細(xì)胞化療敏感性的影響方法1.選擇本實(shí)驗(yàn)室保存的有完整隨訪資料、組織中Polβ已進(jìn)行過(guò)測(cè)序的食管癌患者538例,用Kaplan-Meier方法進(jìn)行食管癌患者的生存分析。2.建立穩(wěn)定表達(dá)177-234 nt缺失型polβ的EC9706細(xì)胞株,采用MTT和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)177-234 nt缺失型polβ對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706化療敏感性的影響。3.將穩(wěn)定表達(dá)177-234 nt缺失型polβ和野生型βolβ的EC9706細(xì)胞株接種到裸鼠右側(cè)腋下。按照3 mg/kg(順鉑/裸鼠體重)比例在裸鼠腹腔注射順鉑生理鹽水溶液,三天一次。接種4周后處死裸鼠。剝離瘤體組織標(biāo)本,拍照、稱重。4.在鏈霉親和素磁珠上偶聯(lián)生物素標(biāo)記的177-234 nt缺失型polβ蛋白,與食管癌細(xì)胞裂解液孵育,分離結(jié)合蛋白后用質(zhì)譜分析。5.采用BIAcore與pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PIK3IP1是否可與177-234 nt缺失型polβ蛋白結(jié)合。6.采用Western blot方法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)177-234 nt缺失型polβ對(duì)EC9706細(xì)胞中PI3K-Akt通路蛋白表達(dá)水平的影響。7.采用MTT和流式細(xì)胞術(shù)方法比較Knock-down PIK3IP1與177-234 nt缺失型polβ對(duì)EC9706細(xì)胞化療敏感性的影響。8.在177-234 nt缺失型polβ的EC9706細(xì)胞中加入PI3K抑制劑LY294002,采用MTT和流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)PI3K抑制劑對(duì)177-234 nt缺失型polβ影響EC9706化療敏感性的回復(fù)作用。結(jié)果1.Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,177-234 nt缺失型polβ患者生存期遠(yuǎn)差于野生型polp的患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.與野生型polβ細(xì)胞相比,177-234 nt缺失型polβ可減弱順鉑/5-FU對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制、增加凋亡促進(jìn),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,177-234nt缺失型polβ組裸鼠移植瘤體重明顯大于野生型裸鼠移植瘤體重(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果,分析EC9706細(xì)胞中PIK3IP1蛋白可能與177-234nt缺失型polβ蛋白結(jié)合。5.BIAcore 與 pull-down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PIK3IP1 可與 177-234 nt 缺失型 polβ蛋白結(jié)合。6.Western blot結(jié)果顯示,177-234nt缺失型polβ可促進(jìn)Akt蛋白的磷酸化,從而抑制下游凋亡基因的活化、促進(jìn)下游增殖基因的活化。7.與βolβ-/-組相比,PIK3IP1 siRNA和177-234 nt缺失型polβ組細(xì)胞中順鉑/5-FU的增殖抑制能力和凋亡促進(jìn)作用均減弱,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而PIK3IP1 siRNA和177-234nt缺失型polβ組間沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。8.MTT和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PI3K抑制劑LY294002可通過(guò)抑制PI3K活化,增強(qiáng)順鉑/5-FU對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn),部分回復(fù)177-234 nt缺失型polβ對(duì)EC9706細(xì)胞化療敏感性的作用。結(jié)論1.miR-499通過(guò)靶向polβ 3'UTR調(diào)控polβ表達(dá)水平,增強(qiáng)順鉑對(duì)EC9706和KYSE30細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用,提高食管癌細(xì)胞的化療敏感性。2.177-234 nt缺失型polβ蛋白可通過(guò)結(jié)合PIK3IP1蛋白激活PI3K通路,減弱順鉑/5-FU對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用,降低食管癌細(xì)胞的化療敏感性。
【圖文】：

邐Ｔｕｍｏｒ邐Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１－５食管癌組織和癌旁組織中ｐｏｌｐ邋ｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)水平逡逑Ｔｕｍｏｒ：食管癌組織，Ｎｏｒｍａｌ：正常癌旁組織＊Ｐ＜邋０．０５逡逑２９逡逑

邐Ｔｕｍｏｒ邐Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１－４食管癌癌組織和癌旁組織中ｍｉＲ－４９９的相對(duì)表達(dá)量逡逑Ｔｕｍｏｒ：食管癌組織，Ｎｏｒｍａｌ：正常癌旁組織。＊尸＜０．０５逡逑４．２食管癌組織標(biāo)本中ｐｏｌ卩表達(dá)水平的檢測(cè)逡逑４．２．１食管癌癌組織中ｐｏｉｐ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平檢測(cè)逡逑Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ結(jié)果顯示，食管癌組織中ｐｏｌｐｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)水平（１．２１９逡逑±邋０．２８７）明顯高于癌旁組織（０．４１２邋±０．１０７），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜邋０．０５，逡逑表邋１－３，圖邋１－５）。逡逑表１－３食管癌組織和癌旁組織中ｐｏｌ（３邋ｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)水平逡逑組織邐ｎ邐ｐｏｌｐｍＲＮ＾相對(duì)表達(dá)量邐戶值逡逑食管癌組織邐５３８邐１．２１９邋±０．２８７逡逑正常癌旁組織邐５３８邐０．４１２邋±０．１０７邐逡逑Ｃ逡逑0逡逑２邋２０１逡逑Ｑ．逡逑Ｘ邐＊逡逑ＬＬｌ邋１．５－邐＂＂Ｉ＂邐１逡逑＜邐Ｉ逡逑｜邋１．０－逡逑Ｉ．０－５＇邐￣Ｔ￣逡逑ａ＞逡逑名邋ｏ．ｏ＾邐邐１邐邋邋１邐逡逑ｉＳ邐Ｔｕｍｏｒ邐Ｎｏｒｍａｌ逡逑圖１－５食管癌組織和癌旁組織中ｐｏｌｐ邋ｍＲＮＡ的相對(duì)表達(dá)水平逡逑Ｔｕｍｏｒ：食管癌組織，Ｎｏｒｍａｌ：正常癌旁組織＊Ｐ＜邋０．０５逡逑２９逡逑
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2639221