發(fā)布時間：2020-04-23 09:52

【摘要】：食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,我國是食管癌高發(fā)國家之一,在全世界范圍內(nèi),每年被確診食管癌的患者中,我國患者大約占全世界的50%。研究表明,RMP(RPB5-Mediating Protein)的異常表達在肝癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。RMP可能通過影響增殖、凋亡、周期等相關(guān)關(guān)鍵因子從而發(fā)揮一個潛在癌基因的功能。我們一方面通過測定RMP在食管鱗癌中的表達來研究其對食管鱗癌細胞生物學功能的影響;另一方面,通過臨床數(shù)據(jù),探究RMP在判斷食管鱗癌預后及評估術(shù)后化療中的療效。探尋RMP在食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起到的作用,有望為食管鱗癌的預后和評估提供新的標記物。一、RMP在食管鱗癌中的表達及其對細胞生物學功能的影響目的:通過測定RMP在人食管鱗癌組織和細胞系中的表達水平,來研究RMP與腫瘤病人臨床病理特征的聯(lián)系,同時探索其對食管鱗癌細胞生物學功能的影響,為食管鱗癌的基因靶向治療提供強有力的依據(jù)。鑒于這些實驗,我們在這項研究中檢測了RMP在食管鱗癌中的表達,已經(jīng)敲低或者過表達RMP對食管鱗癌細胞的增殖、侵襲的影響等細胞行為,以及對放化療的敏感性。在臨床水平,我們研究了RMP對食管鱗癌預后及評估術(shù)后化療療效。通過這項研究,我們有望對食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展的機制有更深一步的認識,為發(fā)現(xiàn)食管鱗癌新的分子標記物和預后判斷提供新的證據(jù)。方法:1.通過q RT-PCR檢測RMP在食管鱗癌細胞系和正常細胞系中的m RNA表達水平,同時用western blot檢測RMP相應的蛋白表達水平。2.通過q RT-PCR檢測RMP在人食管鱗癌組織和相應癌旁組織中的m RNA表達水平,同時用western blot檢測RMP相應的蛋白表達水平。3.通過q RT-PCR檢測RMP在不同特征食管鱗癌組織樣本中的m RNA表達水平,分析其與腫瘤臨床病理特征的聯(lián)系,同時用表格統(tǒng)計病人的相關(guān)臨床信息。4.熒光顯微鏡檢測各組RMP質(zhì)粒在食管鱗癌細胞Eca109和Ec9706中的瞬時轉(zhuǎn)染情況,同時用q RT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。5.通過CCK-8試驗檢測RMP對Eca109和Ec9706細胞增殖的影響。6.用不同濃度的吉非替尼處理轉(zhuǎn)染了各組不同RMP質(zhì)粒的Eca109和Ec9706細胞,通過CCK-8試驗、流式細胞術(shù)檢測RMP對Eca109和Ec9706細胞化療敏感性的影響。7.通過CCK-8試驗、流式細胞術(shù)檢測RMP對Eca109和Ec9706細胞放療敏感性的影響,同時用western blot檢測細胞凋亡相關(guān)基因的蛋白表達水平。8.通過流式細胞術(shù)檢測RMP對于Eca109和Ec9706細胞周期的影響,同時用western blot檢測周期相關(guān)基因的蛋白表達水平。9.通過遷移和侵襲試驗檢測RMP對Eca109和Ec9706細胞遷移和侵襲能力的改變。10.通過裸鼠皮下移植瘤實驗觀察RMP對移植瘤生長情況的影響,同時用免疫組化檢測RMP、Bax、Bcl-2和capase-3的蛋白表達情況。11.對臨床病人數(shù)據(jù)隨訪分析,研究RMP對食管鱗癌預后及評估術(shù)后化療療效。結(jié)果:1.q RT-PCR和western blot實驗結(jié)果顯示:無論是m RNA和蛋白表達水平,RMP在食管鱗癌細胞系中均呈相應的高表達狀態(tài)。2.q RT-PCR和western blot實驗結(jié)果表明:與癌旁組織相比,RMP在人食管鱗癌組織中的m RNA和蛋白的表達水平均明顯提高。同時發(fā)現(xiàn)RMP的表達與腫瘤組織的淋巴結(jié)和T-stage狀態(tài)有關(guān),與病人的年齡、性別和腫瘤類型無關(guān)。3.熒光顯微鏡、q RT-PCR和western blot實驗表明:各組RMP質(zhì)粒在Eca109和Ec9706細胞中瞬時轉(zhuǎn)染順利,m RNA和蛋白表達水平呈相應的提高。4.CCK-8試驗表明:RMP明顯促進Eca109和Ec9706細胞的增殖。5.CCK-8試驗表明:在化療藥物劑量逐漸增加的作用下,RMP仍能夠減緩Eca109和Ec9706細胞的死亡;流式細胞術(shù)檢測表明:RMP能夠減少化療引起的細胞凋亡。6.CCK-8試驗表明:在輻射劑量逐漸增加的作用下,RMP仍能夠減緩Eca109和Ec9706細胞的死亡;流式細胞術(shù)檢測表明:RMP能減少放療引起的細胞凋亡;western blot實驗檢測表明:在放療后,RMP能夠抑制Eca109和Ec9706細胞中凋亡相關(guān)基因蛋白的表達,促進抗凋亡相關(guān)基因蛋白的表達。7.流式細胞術(shù)檢測表明:RMP能夠減少由放療引起的Eca109和Ec9706細胞周期G2期的阻滯,同時western blot實驗表明:放療后,RMP能夠調(diào)節(jié)Eca109和Ec9706中細胞周期相關(guān)基因蛋白的表達。8.遷移和侵襲試驗表明:RMP能夠促進Eca109和Ec9706細胞的遷移和侵襲能力。9.裸鼠皮下移植瘤實驗表明:RMP能夠促進移植瘤的生長,同時免疫組化檢測表明:RMP能夠抑制凋亡相關(guān)基因蛋白的表達,促進抗凋亡相關(guān)基因蛋白的表達,從而促進腫瘤的生長。10.臨床數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示RMP高表達提示食管鱗癌生存期短,可能是預后差的一個指標,并可能提示對鉑類藥物耐藥。結(jié)論:1.RMP在人食管鱗癌中呈高表達的狀態(tài),說明RMP可能與食管鱗癌的生長和惡性程度有著密切的聯(lián)系,是潛在的一種食管鱗癌相關(guān)促癌基因。2.RMP的過表達能夠改變Eca109和Ec9706如細胞增殖、凋亡、周期、遷移和侵襲等各項生物學功能,促進移植瘤的生長,進一步表明RMP在食管鱗癌中扮演著癌基因的角色,為我們對食管癌的基因靶向治療又提供一個強有力的目標。二、RMP判斷食管鱗癌預后及評估術(shù)后化療療效的研究目的:本研究旨在分析食管鱗癌RMP的表達率,探討其表達對食管鱗癌的預后的影響,及其與晚期食管鱗癌含鉑類方案化療療效的相關(guān)性。方法:統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。生存分析采用Kaplan-Meier方法,組間比較應用Log-rank檢驗,預后分析采用COX風險比例回歸模型。RMP與化療療效關(guān)系采用計數(shù)資料比較采用X,檢驗。取P0.05為具有統(tǒng)計學意義標準。免疫組織化學法對共59例患者的石蠟標本切片進行檢測RMP的表達情況,檢測RMP在不同患者中的表達水平。結(jié)果:本組114例食管鱗癌患者單因素分析總生存期:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、腫瘤新分期、RMP表達、是否化療、腫瘤分化程度、抽煙及BMI對OS有顯著影響的因素,P值分別為0.003,0.032,0.039,0.018,0.022,0.034,0.069。多因素分析結(jié)果:只有腫瘤分期是獨立的預后因素,P值為0.016。RMP的P值為0.089,未見統(tǒng)計學差異。單因素分析無病生存期,結(jié)果顯示:腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目,RMP表達,脈管瘤栓和ECOG,P值分別為0.034,0.001,0.007,0.038,0.058。具有統(tǒng)計學差異。多因素分析:只有分期和ECOG評分是獨立的預后因素,P值為0.019,0.037。單因素分析無進展生存期結(jié)果:化療療效、化療周期數(shù)、是否順鉑足量化療、性別、抽煙,P值分別為0.001,0.012,0.045,0.022,0.016。多因素分析:只有化療療效、是否順鉑足量化療是獨立的預后因素,P值分別為0.000,0.043。RMP表達與晚期食管鱗癌含順鉑方案化療療效未看到統(tǒng)計學相關(guān)性,但亞組分析順鉑足量化療患者RMP表達與化療療效進行卡方檢驗,P值為0.038,具有顯著統(tǒng)計學差異,提示RMP陽性者可能順鉑耐藥,生存期短,但尚需進一步證實。結(jié)論:RMP高表達提示食管鱗癌生存期短,可能是預后差的一個指標,并可能提示對鉑類藥物耐藥。
【圖文】：

細胞癌中的表達狀細胞癌細胞系中的表達情況細胞，分別為正常食管上皮細胞用上述引物，取各組細胞總 RNA2.0反應[39]。測定3組細胞RMP的mRNP 在食管鱗癌細胞 Eca109 和 Ec970EEC 中的表達水平(p<0.05)， 圖 2一抗，以及 HRP 標記的二抗進行 現(xiàn)食管鱗癌細胞 Eca109 和 Ec9706 中EC。以上結(jié)果表明：在細胞水平中，現(xiàn)為相對于人的正常食管上皮細胞明顯的高表達，預示它可能參與食管

圖 2 正常食管細胞和食管鱗癌細胞中 RMP 的蛋白水平MP 在食管鱗狀細胞癌病人組織和相應癌旁組織中的表達情況醫(yī)院手術(shù)臨床樣本，分別為人食管鱗癌組織和相鄰癌旁組織，，提取各組織樣本中的 RNA，以 RNA2.0μg 做為模板，按照T-PCR 反應。測定二組樣本中 RMP 的 mRNA 水平和蛋白表達發(fā)現(xiàn) RMP 在人食管鱗癌組織中的 mRNA 水平明顯高于其相(p<0.05)， 圖 4 按上述方法裂解組織提取蛋白，用 RMP 抗體P 標記的二抗進行 Western blot 檢測，在蛋白水平進行了驗臨床人食管鱗癌組織和相鄰癌旁組織 RMP 無論是在基因的水平，表現(xiàn)為在食管鱗癌組織中呈明顯的高表達，預示著它生相關(guān)，且臨床樣本實驗結(jié)果和細胞中 RMP 的表達水平結(jié)果
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 ;CTTN (EMS1): an oncogene contributing to the metastasis of esophageal squamous cell carcinoma[J];Cell Research;2007年04期

2 ;Overexpression of Aurora-A kinase promotes tumor cell proliferation and inhibits apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cell line[J];Cell Research;2006年04期

3 ;Expression of MRP14 gene is frequently down-regulated in Chinese human esophageal cancer[J];Cell Research;2004年01期

4 DORJBAL DORJSUREN,SEISHI MURAKAMI;Interaction with general transcription factor ⅡF (TFⅡF) is required for the suppression of activated transcription by RPB5-mediating protein(RMP)[J];Cell Research;2003年02期

本文編號：2637604