【摘要】：研究背景食管癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái),雖然食管癌的診斷和治療方法有所進(jìn)步,但患者的總體預(yù)后仍不理想。在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中,淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要作用,是影響食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。然而,目前關(guān)于食管癌淋巴管生成的機(jī)制尚不明確。PGRN(progranulin)是類生長(zhǎng)因子樣分泌蛋白,在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。在腫瘤中,PGRN被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌和卵巢癌等腫瘤中高表達(dá),與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。PGRN主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B(PKB/AKT)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)等信號(hào)通路在腫瘤的增殖、遷移、血管生成和惡性轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮作用。但是,食管癌中PGRN的表達(dá)情況及其對(duì)食管癌淋巴管生成作用的影響,尚不清楚。VEGF-C是調(diào)節(jié)腫瘤淋巴管生成的重要因子,可以通過(guò)激活VEGFR-3促進(jìn)淋巴管的形成和生長(zhǎng),與食管癌等腫瘤組織中的淋巴管密度(LMVD)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有意思的是,研究發(fā)現(xiàn),VEGF-C是磷酸化的ERK、AKT和JNK通路的下游信號(hào)。PGRN對(duì)這些信號(hào)通路的調(diào)控是否可以影響VEGF-C的表達(dá),從而影響食管癌的淋巴管生成等問(wèn)題亦有待研究。研究目的明確PGRN在食管癌中的表達(dá)情況,探討其對(duì)食管癌淋巴管生成的作用及其可能機(jī)制,分析PGRN在食管癌中的表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響并建立預(yù)后預(yù)測(cè)模型。研究方法1.RT-PCR、Western blot檢測(cè)PGRN及淋巴管生成因子VEGF-C在不同EC細(xì)胞系包括TE-1,Eca109,K410,K450中的表達(dá)。2.免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)PGRN在食管癌組織的表達(dá),并進(jìn)一步分析食管癌組織中PGRN表達(dá)與患者臨床參數(shù)的關(guān)系。檢測(cè)Ki67和D2-40在食管癌組織中的表達(dá),并分析PGRN與ki67表達(dá)和淋巴管密度(LMVD)、淋巴管侵犯(LVSI)的相關(guān)性。3.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN質(zhì)粒或空載體轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞TE-1,獲得干擾PGRN表達(dá)的食管癌細(xì)胞TE-1-PGRN-sh及對(duì)照細(xì)胞株TE-1-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PGRN質(zhì)�；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞TE-1,獲得過(guò)表達(dá)PGRN的細(xì)胞株 TE-1-PGRN-vector 及對(duì)其照細(xì)胞株 TE-l-NC-vector。RT-PCR、Western blot確定轉(zhuǎn)染效率。在TE-1細(xì)胞中分別下調(diào)和上調(diào)PGRN表達(dá)后,使用PT-PCR、Western blot方法檢測(cè)VEGF-C的變化。4.磷酸化ERK、AKT和JNK被認(rèn)為是VEGF-C的上游信號(hào)。Western blot方法檢測(cè)PGRN對(duì)ERK、AKT和JNK磷酸化水平的影響,并篩選出PGRN-vector對(duì)這些上游信號(hào)的效果。篩選出通路信號(hào)靶點(diǎn)后,加入相應(yīng)的通路阻滯劑,檢測(cè)PGRN誘導(dǎo)的VEGF-C表達(dá)的變化,以明確PGRN調(diào)節(jié)VEGF-C的信號(hào)通路。5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF-C、p-ERK、AKT、p-AKT在食管癌組織中的表達(dá),并分析 PGRN 與 VEGF-C、p-ERK、AKT、p-AKT 的相關(guān)性。6.應(yīng)用Kaplan-Meier曲線分析高PGRN和低PGRN表達(dá)食管癌患者的總生存期(overall survival,OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS),并應(yīng)用Log-rank方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。7.應(yīng)用Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并建立列線圖預(yù)后預(yù)測(cè)模型。研究結(jié)果1.PGRN在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其與VEGF-C表達(dá)的相關(guān)性RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PGRN在食管癌細(xì)胞系TE-1,Eca109,K410,K450中均有表達(dá);Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),除K410外,其他食管癌細(xì)胞系中均有不同程度的PGRN表達(dá)。RT-PCR 和 Western blot檢測(cè)證實(shí),VEGF-C 與 PGRN 在 TE-1,Eca109,K450細(xì)胞中共表達(dá)。提示,在食管癌中PGRN和VEGF-C的表達(dá)存在相關(guān)性。2.上/下調(diào)TE-1細(xì)胞中PGRN的表達(dá)對(duì)VEGF-C表達(dá)的影響分別應(yīng)用 PGRN-vector 和 siRNA(PGRN-shl,PGRN-sh2 和 PGRN-sh3)上、下調(diào)TE-1細(xì)胞中PGRN表達(dá),RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF-C的表達(dá)呈相同的變化趨勢(shì)。3.TE-1細(xì)胞中PGRN對(duì)VEGF-C的表達(dá)調(diào)控可能通過(guò)p-ERK和p-AKT通路實(shí)現(xiàn)上調(diào)PGRN表達(dá)后,TE-1細(xì)胞中p-ERK,p-AKT和VEGF-C的表達(dá)上升,ERK,AKT,JNK,p-JNK的表達(dá)無(wú)明顯變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),加入p-ERK抑制劑U0126可以阻斷PGRN對(duì)p-ERK和VEGF-C的誘導(dǎo)效應(yīng);加入p-AKT抑制劑LY294002可以減弱PGRN對(duì)p-AKT和VEGF-C的誘導(dǎo)作用。因此,PGRN可能通過(guò)p-ERK和p-AKT信號(hào)通路調(diào)控食管癌細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)。4.PGRN在食管癌組織中的表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LMVD及LVSI密切相關(guān)我們收集了 96例食管癌患者的腫瘤標(biāo)本和這些患者的臨床病理資料。研究發(fā)現(xiàn),PGRN高表達(dá)的患者比低表達(dá)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移幾率明顯增高(69%VS46%,P=0.03),但是PGRN的表達(dá)和患者年齡、性別、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、病理類型、腫瘤分級(jí)等臨床病理參數(shù)無(wú)相關(guān)性。PGRN高表達(dá)的患者同時(shí)表達(dá)高水平的D2-40(LMVD的標(biāo)志物)(P=0.016),具有較高的LVSI陽(yáng)性率(67%vs46%,P=0.04)。PGRN的表達(dá)與腫瘤組織LMVD(r=0.30,P=0.003)、LVSI(r=0.21,P=0.039)密切相關(guān)。5.PGRN在食管癌組織中的表達(dá)與VEGF-C、p-ERK及p-AKT密切相關(guān)高表達(dá)PGRN的患者也表達(dá)較高水平的VEGF-C(P0.001),p-ERK(P0.001),和 p-AKT(P=0.035),且 PGRN 的表達(dá)與 VEGF-C(r=0.39,P=0.001),p-ERK(r=0.33,P=0.001)和p-AKT(r=0.30,P=0.03)的表達(dá)正相關(guān)。因此,體內(nèi)研究證實(shí),PGRN可能通過(guò)p-ERK和p-AKT調(diào)控VEGF-C的表達(dá),促進(jìn)食管癌的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。6.PGRN在食管癌中的表達(dá)對(duì)患者生存的影響Kaplan-Meier曲線顯示高表達(dá)PGRN的患者的OS及PFS較低表達(dá)者均顯著縮短。Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析提示高PGRN表達(dá)的患者比低PGRN表達(dá)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)高1.99倍(95%的可信區(qū)間1.05～3.78,P=0.035);疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)提高2.88倍(95%可信區(qū)間:1.55～5.35,P=0.001)。7.食管癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)模型的建立Cox回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示,TNM分期(hazard ratio:2.64,95%可信區(qū)間1.07～6.50;P=0.035),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(hazard ratio:1.31,95%可信區(qū)間 2.26～7.56;P0.001),PGRN 表達(dá)水平(hazard ratio:1.36,95%可信區(qū)間 1.05～1.77;P=0.022),ERK 磷酸化程度(hazard ratio:1.42,95%可信區(qū)間 1.07～1.89;P=0.016)是食管癌死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素�；谶@四項(xiàng)獨(dú)立預(yù)后因素建立列線圖模型,可用于食管癌患者的預(yù)后評(píng)估。結(jié)論1.PGRN在食管癌高表達(dá),與食管癌的淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2.PGRN可能通過(guò)p-AKT、p-ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)食管癌淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用。3.PGRN高表達(dá)與食管癌患者不良預(yù)后相關(guān),是食管癌患者獨(dú)立預(yù)后因素之一。4.基于TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PGRN表達(dá)、ERK磷酸化程度建立的列線圖模型可以用于食管癌患者的預(yù)后評(píng)估。
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圖１邋ＰＧＲＮ在４種食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)逡逑Ａ．邋ＲＴ－ＰＣＲ邋檢測(cè)邋ＰＧＲＮ邋在邋ＴＥ－ｌ，Ｅｃａｌ０９，邋ｋ４１０，ｋ４５０邋細(xì)胞系中的表達(dá)，ＧＡＰＤＨ邋ｍＲＮＡ逡逑作為內(nèi)對(duì)照；Ｂ．邋Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋檢測(cè)邋ＰＧＲＮ邋在邋ＴＥ－１，Ｅｃａｌ０９，，邋ｋ４１０，邋ｋ４５０邋細(xì)胞逡逑系中的表達(dá)。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

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