【摘要】：目的1.研究Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞是否對索拉非尼耐藥。2.探索低濃度二甲雙胍能否增強(qiáng)索拉非尼抑制Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖,并研究其作用原理。方法1.采用無血清干細(xì)胞富集培養(yǎng)基對人肝癌細(xì)胞系Hep G2進(jìn)行富集培養(yǎng),獲得干細(xì)胞樣細(xì)胞懸浮球,并在熒光倒置顯微鏡明場下拍照記錄懸浮球生長過程中形態(tài)變化,測量懸浮球直徑并計算懸浮球數(shù)目。收集傳代3代以上且懸浮成球生長6天的Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞表面CD133及CD90分子的陽性表達(dá)率。2.將Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞和Hep G2細(xì)胞以1000個/孔(24孔板)的密度種于上層瓊脂膠濃度為0.4%,下層瓊脂膠濃度為1%的軟瓊脂膠中,培養(yǎng)13天,比較兩組細(xì)胞的克隆形成能力。3.采用濃度為5μM、10μM、15μM、20μM、25μM的索拉非尼處理Hep G2細(xì)胞和Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞,分別作用24h、48h和72h,通過CCK8法檢測細(xì)胞活性,選擇最佳藥物作用時間,并在熒光倒置顯微鏡明場下拍照記錄懸浮球形態(tài)大小及數(shù)目變化,以不加藥組為對照組比較兩組細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。4.采用濃度為1m M、3m M、5m M的二甲雙胍與5μM索拉非尼聯(lián)合處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞,分別作用24h、48h和72h,通過CCK8法檢測細(xì)胞增殖活性,同時在熒光倒置顯微鏡明場下拍照記錄懸浮球形態(tài)大小及數(shù)目變化,以不加藥組為對照組計算二甲雙胍與索拉非尼聯(lián)合處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞對Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長抑制率,并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。選擇二甲雙胍最佳藥物濃度及作用時間。5.采用Western blot法檢測Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞和Hep G2細(xì)胞中EMT相關(guān)基因Vimentin、Twist1、Snail及E-cadherin的表達(dá)。分別采用濃度為1m M、5m M的二甲雙胍處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞48h,通過Western blot法檢測上述各處理組中Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞中的EMT相關(guān)基因Vimentin、Twist1、Snail及E-cadherin的表達(dá),并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果1.富集培養(yǎng)第3d可以觀察到懸浮球形成,懸浮球直徑及數(shù)目會隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而不斷增大,但培養(yǎng)懸浮球至第6天左右時,懸浮球數(shù)目未見增加,而細(xì)胞球直徑仍繼續(xù)增長。Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞表面CD133分子陽性表達(dá)率為(5.59+0.31)%,CD90分子陽性表達(dá)率為(9.57+0.29)%;Hep G2細(xì)胞表面CD133分子陽性表達(dá)率為(0.33+0.32)%,CD90分子陽性表達(dá)率為(0.8+0.26)%。兩組細(xì)胞表面CD133及CD90分子的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=165.3,P0.001;t=27.99,P0.05)。2.Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞和Hep G2細(xì)胞在軟瓊脂膠中培養(yǎng)13天,Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞克隆形成率為(35.5~39.5)%;Hep G2細(xì)胞克隆形成率為(17.2~19.0)%,兩組細(xì)胞之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.58,P0.01)。3.索拉非尼處理Hep G2細(xì)胞與Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的最佳的作用時間為48h。索拉非尼對Hep G2細(xì)胞與Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的IC50值分別為10.40μM和15.10μM。4.二甲雙胍聯(lián)合索拉非尼處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞最佳的作用時間為48h。濃度為1m M、3m M、5m M的二甲雙胍聯(lián)合5μM索拉非尼處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞48h對Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長抑制率分別為(27.73+5.52)%、(32.20+4.25)%、(35.11+4.06)%,而5μM索拉非尼單獨(dú)處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞48h對Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長抑制率為(22.07+2.17)%。濃度為3m M與5m M的二甲雙胍聯(lián)合5μM索拉非尼與5μM索拉非尼單獨(dú)用藥對Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.514,P0.05;t=5.812,P0.01)5.與Hep G2細(xì)胞相比Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞中EMT相關(guān)基因Vimentin、Twist1、Snail表達(dá)上升,E-cadherin表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.205,P0.05;t=5.588,P0.01;t=17.70,P0.001;t=10.87,P0.001)。采用濃度為1m M、5m M的二甲雙胍分別處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞48h,與未處理組相比其EMT相關(guān)基因Vimentin、Twist1,Snail表達(dá)下降,E-cadherin表達(dá)上升。E-cadherin、Vimentin基因表達(dá)只在5m M二甲雙胍與未處理組之間有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.421,P0.01;t=6.793,P0.01)。不同濃度二甲雙胍處理Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞組Twist1、Snail基因表達(dá)均與未處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.810,P0.05,t=7.923,P0.01;t=6.828,P0.01,t=17.7,P0.001)。結(jié)論1.Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞對索拉非尼敏感性下降。2.低濃度二甲雙胍能增強(qiáng)索拉非尼抑制Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖,可能與其抑制Hep G2干細(xì)胞樣細(xì)胞的EMT能力有關(guān)。
【圖文】：

圖 1. HepG2 干細(xì)胞樣細(xì)胞的富集培養(yǎng)Figure 1. Enrichment culture of HepG2 stem-like spheres. Enrichment culture of HepG2 stem-like spheres .(A) Typical bright-field cells cultured in stem cell conditioned medium on days 3, 6 and 9. Magnificati

圖 2.HepG2 干細(xì)胞樣細(xì)胞表面肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)Figure 2. Stem cell markers expressed in HepG2 spheres.Figure 2. Stem cell markers expressed in HepG2 stem cell-like cells. CD133 and CD90expression in parental HepG2 cells and spheres on day 12 was examined by flow cytometr
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 肖蕎;孫姝雯;崔迎紅;曹曉正;曹建國;;索拉菲尼與BrMC合用對SMMC-7721細(xì)胞系肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞凋亡的影響[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2015年01期

2 Tae Il Kim;;Chemopreventive drugs:Mechanisms via inhibition of cancer stem cells in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年14期

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本文編號：2633982