【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)是當(dāng)前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的惡性腫瘤之一,其糟糕的預(yù)后與缺乏有效治療手段之間密不可分。近年來的研究表明,HCC中存在的性別差異現(xiàn)象與雄激素受體AR有著明顯聯(lián)系,而HCC中自然殺傷細(xì)胞(NK cells)又是腫瘤免疫監(jiān)視中不可忽視的一個(gè)角色。研究目的:本篇研究旨在通過分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究,深入闡明AR基因在HCC發(fā)生發(fā)展過程中對(duì)NK細(xì)胞的影響及作用,以及這些作用產(chǎn)生的分子機(jī)制。同時(shí)在針對(duì)HCC的藥物治療時(shí),如何將AR基因作為指導(dǎo)治療的一個(gè)重要因素,使得未來可以妥善將HCC藥物治療與NK細(xì)胞免疫治療相結(jié)合。研究方法:我們基于乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(LDH cytotoxicity assay)對(duì)不同AR表達(dá)狀態(tài)下或藥物處理后的HCC細(xì)胞進(jìn)行了 NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn),確定了何種條件時(shí)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷能力有所變化。隨后利用RT-qPCR對(duì)NK細(xì)胞相關(guān)性分子基因進(jìn)行了篩選,隨后運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù),利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及染色質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn),證明了 AR如何對(duì)NK細(xì)胞相關(guān)基因產(chǎn)生調(diào)控作用。另一方面,相關(guān)藥物對(duì)AR產(chǎn)生的作用我們也使用microRNA相關(guān)試驗(yàn)及蛋白降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究。最后,所有的體外實(shí)驗(yàn)均通過臨床標(biāo)本及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。研究結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),雄激素受體AR可以通過結(jié)合至IL-12A基因啟動(dòng)子特定區(qū)域,轉(zhuǎn)錄抑制IL-12A的表達(dá),從而使得腫瘤微環(huán)境中IL-12表達(dá)量下降,抑制了 NK細(xì)胞對(duì)HCC細(xì)胞的免疫殺傷作用。同時(shí),索拉菲尼可以通過降低AR表達(dá)量從而上調(diào)IL-12A表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)HCC細(xì)胞的殺傷功能。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)順鉑可以通過抑制肝癌細(xì)胞中的AR從而解除AR對(duì)ULBP2的抑制,從而顯著提高HCC腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性。而順鉑對(duì)AR產(chǎn)生的迅速而強(qiáng)效的抑制效果源自于兩種途徑,即順鉑誘導(dǎo)miR-34-5p從而下調(diào)AR,以及增強(qiáng)AR泛素化從而快速降解。這些數(shù)據(jù)同樣也經(jīng)過了臨床標(biāo)本及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。研究結(jié)論:AR作為引起肝細(xì)胞肝癌性別差異的決定性分子,可以通過多種途徑干擾HCC中NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視及殺傷功能。而不同的化學(xué)藥物治療,在針對(duì)其靶向基因產(chǎn)生腫瘤抑制的同時(shí),也可以經(jīng)由對(duì)AR的作用從而產(chǎn)生意想不到的免疫促進(jìn)作用,增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫活性。這些證據(jù)提示在未來的基于NK細(xì)胞的HCC免疫治療中,AR或許可以成為一項(xiàng)提供診療依據(jù)并對(duì)病人進(jìn)行分類的重要分子指標(biāo)。
【圖文】：

圖２．５．１邋Ａ．邋ｐＷＰＩ過表達(dá)空載質(zhì)粒；Ｂ．邋ｐＬＫＯ．ｌ敲減空載質(zhì)粒；Ｃ．邋ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ熒光逡逑素酶報(bào)告質(zhì)粒；Ｄ．ｐＲＬ－ＴＫ熒光素酶報(bào)告內(nèi)參質(zhì)粒；Ｅ．ＧＦＩＭＪｂ過表達(dá)質(zhì)粒

２５０沁Ｂｕｅｒ２，５，，（裂解時(shí)間不要超過５分鐘）；逡逑加入３５０邋ｐｉ邋Ｂｕｆｆｅｒ邋Ｓ３，溫和并上下顛倒５次混勻，室溫１２０００ｒｐｍ離心１５邋ｍｉｎ；逡逑吸取上清液并轉(zhuǎn)移到制備管（置于２ｍｌ離心管），室溫１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，逡逑棄去濾過液；逡逑將制備管置回離心管，，加入５０0ｉａｌＢｕｆｆｅｒＷｌ，邋１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，棄濾液；逡逑將制備管置回離心管，加入７００｜ｉｌＢｕｆｆｅｒＷ２，１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，棄濾液；逡逑重復(fù)Ｗ２洗滌１－２次；逡逑將制備管置回２邋ｍｌ離心管中，室溫１２０００ｒｐｍ離心１邋ｍｉｎ；逡逑將制備管放置入新的１．５邋ｍｌ離心管中，在中央網(wǎng)膜處加入８０｜ｉｌｄｄＨ２Ｏ，室溫逡逑靜置孵育５ｍｉｎ，離心收集濾過液，即為含質(zhì)粒溶液；逡逑）使用ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００超微量分光光度計(jì)對(duì)獲得的質(zhì)粒溶液測(cè)定濃度及純度，逡逑２６０／Ａ２８０在１．８０左右為宜，可在－２０°Ｃ下凍存長(zhǎng)期保存。逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Mamta Kalra;Jary Mayes;Senait Assefa;Anil K Kaul;Rashmi Kaul;;Role of sex steroid receptors in pathobiology of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

本文編號(hào)：2633661