【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(HCC)是當(dāng)前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及致死率最高的惡性腫瘤之一,其糟糕的預(yù)后與缺乏有效治療手段之間密不可分。近年來的研究表明,HCC中存在的性別差異現(xiàn)象與雄激素受體AR有著明顯聯(lián)系,而HCC中自然殺傷細(xì)胞(NK cells)又是腫瘤免疫監(jiān)視中不可忽視的一個角色。研究目的:本篇研究旨在通過分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究,深入闡明AR基因在HCC發(fā)生發(fā)展過程中對NK細(xì)胞的影響及作用,以及這些作用產(chǎn)生的分子機制。同時在針對HCC的藥物治療時,如何將AR基因作為指導(dǎo)治療的一個重要因素,使得未來可以妥善將HCC藥物治療與NK細(xì)胞免疫治療相結(jié)合。研究方法:我們基于乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性實驗(LDH cytotoxicity assay)對不同AR表達(dá)狀態(tài)下或藥物處理后的HCC細(xì)胞進(jìn)行了 NK細(xì)胞殺傷實驗,確定了何種條件時NK細(xì)胞對腫瘤的殺傷能力有所變化。隨后利用RT-qPCR對NK細(xì)胞相關(guān)性分子基因進(jìn)行了篩選,隨后運用分子生物學(xué)技術(shù),利用熒光素酶報告實驗以及染色質(zhì)沉淀實驗,證明了 AR如何對NK細(xì)胞相關(guān)基因產(chǎn)生調(diào)控作用。另一方面,相關(guān)藥物對AR產(chǎn)生的作用我們也使用microRNA相關(guān)試驗及蛋白降解實驗進(jìn)行了研究。最后,所有的體外實驗均通過臨床標(biāo)本及動物體內(nèi)實驗進(jìn)行了驗證。研究結(jié)果:實驗結(jié)果證實,雄激素受體AR可以通過結(jié)合至IL-12A基因啟動子特定區(qū)域,轉(zhuǎn)錄抑制IL-12A的表達(dá),從而使得腫瘤微環(huán)境中IL-12表達(dá)量下降,抑制了 NK細(xì)胞對HCC細(xì)胞的免疫殺傷作用。同時,索拉菲尼可以通過降低AR表達(dá)量從而上調(diào)IL-12A表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)NK細(xì)胞對HCC細(xì)胞的殺傷功能。另一方面,我們發(fā)現(xiàn)順鉑可以通過抑制肝癌細(xì)胞中的AR從而解除AR對ULBP2的抑制,從而顯著提高HCC腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性。而順鉑對AR產(chǎn)生的迅速而強效的抑制效果源自于兩種途徑,即順鉑誘導(dǎo)miR-34-5p從而下調(diào)AR,以及增強AR泛素化從而快速降解。這些數(shù)據(jù)同樣也經(jīng)過了臨床標(biāo)本及動物體內(nèi)實驗的證實。研究結(jié)論:AR作為引起肝細(xì)胞肝癌性別差異的決定性分子,可以通過多種途徑干擾HCC中NK細(xì)胞對腫瘤的免疫監(jiān)視及殺傷功能。而不同的化學(xué)藥物治療,在針對其靶向基因產(chǎn)生腫瘤抑制的同時,也可以經(jīng)由對AR的作用從而產(chǎn)生意想不到的免疫促進(jìn)作用,增強NK細(xì)胞對腫瘤的免疫活性。這些證據(jù)提示在未來的基于NK細(xì)胞的HCC免疫治療中,AR或許可以成為一項提供診療依據(jù)并對病人進(jìn)行分類的重要分子指標(biāo)。
【圖文】：

圖２．５．１邋Ａ．邋ｐＷＰＩ過表達(dá)空載質(zhì)粒；Ｂ．邋ｐＬＫＯ．ｌ敲減空載質(zhì)粒；Ｃ．邋ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ熒光逡逑素酶報告質(zhì)粒；Ｄ．ｐＲＬ－ＴＫ熒光素酶報告內(nèi)參質(zhì)粒；Ｅ．ＧＦＩＭＪｂ過表達(dá)質(zhì)粒

２５０沁Ｂｕｅｒ２，５，，（裂解時間不要超過５分鐘）；逡逑加入３５０邋ｐｉ邋Ｂｕｆｆｅｒ邋Ｓ３，溫和并上下顛倒５次混勻，室溫１２０００ｒｐｍ離心１５邋ｍｉｎ；逡逑吸取上清液并轉(zhuǎn)移到制備管（置于２ｍｌ離心管），室溫１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，逡逑棄去濾過液；逡逑將制備管置回離心管，，加入５０0ｉａｌＢｕｆｆｅｒＷｌ，邋１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，棄濾液；逡逑將制備管置回離心管，加入７００｜ｉｌＢｕｆｆｅｒＷ２，１２０００ｒｐｍ離心ｌｍｉｎ，棄濾液；逡逑重復(fù)Ｗ２洗滌１－２次；逡逑將制備管置回２邋ｍｌ離心管中，室溫１２０００ｒｐｍ離心１邋ｍｉｎ；逡逑將制備管放置入新的１．５邋ｍｌ離心管中，在中央網(wǎng)膜處加入８０｜ｉｌｄｄＨ２Ｏ，室溫逡逑靜置孵育５ｍｉｎ，離心收集濾過液，即為含質(zhì)粒溶液；逡逑）使用ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００超微量分光光度計對獲得的質(zhì)粒溶液測定濃度及純度，逡逑２６０／Ａ２８０在１．８０左右為宜，可在－２０°Ｃ下凍存長期保存。逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Mamta Kalra;Jary Mayes;Senait Assefa;Anil K Kaul;Rashmi Kaul;;Role of sex steroid receptors in pathobiology of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

本文編號：2633661