【摘要】：研究背景p16作為腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物現(xiàn)已廣泛用于臨床病理診斷,且p16蛋白胞漿易位多與惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinases 4,CDK4)與p16蛋白的亞細(xì)胞定位高度一致,主要為胞漿表達(dá)或漿核共表達(dá)。同時(shí)有研究表明,p16蛋白的錨蛋白重復(fù)序列中第84位的天冬氨酸(即D84位點(diǎn))能與CDK4的第24位的精氨酸(即R24位點(diǎn))通過靜電引力結(jié)合而發(fā)揮作用,并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有p16/CDK4蛋白復(fù)合體的存在。因此我們推測乳腺癌中p16蛋白胞漿易位與胞漿中p16/CDK4復(fù)合體有關(guān),該復(fù)合體使得p16蛋白滯留于胞漿,不能進(jìn)入胞核,致使胞漿p16蛋白表達(dá)上調(diào)。因此,本研究以乳腺癌BT549細(xì)胞為基礎(chǔ),構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CDK4、CDK4的R24位點(diǎn)突變體(CDK4R24C,為CDK4第24位的精氨酸CGU突變?yōu)榘腚装彼酻GU)及CDK4基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞系,通過細(xì)胞免疫熒光及western方法檢測CDK4不同表達(dá)狀態(tài)對(duì)p16蛋白亞細(xì)胞定位的影響,初步探討p16蛋白亞細(xì)胞定位的分子機(jī)制。研究目的 分析乳腺癌細(xì)胞中CDK4蛋白不同表達(dá)狀態(tài)對(duì)p16蛋白亞細(xì)胞定位的影響,初步探討p16蛋白亞細(xì)胞定位的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.通過細(xì)胞免疫熒光,觀察乳腺癌BT549和MCF7細(xì)胞系中CDK4、p16蛋白的亞細(xì)胞定位。2.通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time RT-PCR)及western篩選能使CDK4基因表達(dá)下調(diào)的最佳干擾質(zhì)粒(干擾質(zhì)粒pGPU6-sh1、pGPU6-sh2、pGPU6-sh3、pGPU6-sh4由上海吉瑪公司構(gòu)建并合成)。3.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CDK4、CDK4R24C及CDK4基因表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(質(zhì)粒pEGFP-CDK4、pEGFP-CDK4R24C由通用生物公司構(gòu)建并合成)并鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)系是否構(gòu)建成功。4.細(xì)胞免疫熒光及western檢測CDK4不同表達(dá)狀態(tài)時(shí),p16蛋白亞細(xì)胞定位的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),乳腺癌BT549和MCF7細(xì)胞系中CDK4、p16蛋白均有表達(dá),且p16蛋白主要定位于胞漿或胞漿胞核均有分布,CDK4為胞漿胞核均有分布,兩種蛋白存在共定位關(guān)系。2.Real-time RT-PCR及western結(jié)果顯示質(zhì)粒pGPU6-sh1、pGPU6-sh4的CDK4基因表達(dá)下調(diào)效果明顯,其中pGPU6-sh4最為明顯。3.將構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-CDK4、pEGFP-CDK4R24C的細(xì)胞系DAPI染色后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,兩種細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞的比例接近100%,western檢測出兩種細(xì)胞均有GFP蛋白表達(dá),表明穩(wěn)轉(zhuǎn)系構(gòu)建成功。4.將構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)pGPU6-sh1、pGPU6-sh4的細(xì)胞系提取細(xì)胞總蛋白,western檢測CDK4的表達(dá),結(jié)果顯示,上述兩種細(xì)胞中CDK4蛋白下調(diào)明顯,其中以質(zhì)粒pGPU6-sh4的穩(wěn)轉(zhuǎn)系下調(diào)效果最為明顯,表明穩(wěn)轉(zhuǎn)系構(gòu)建成功。5.細(xì)胞免疫熒光及western檢測穩(wěn)定表達(dá)pEGFP-CDK4、pEGFP-CDK4R24C及pGPU6-sh4中p16蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示CDK4過表達(dá)時(shí),p16蛋白在胞漿中表達(dá)上調(diào),在胞核中表達(dá)下調(diào);CDK4的R24位點(diǎn)突變(CDK4R24C)及CDK4基因表達(dá)下調(diào)時(shí),p16蛋白在胞漿中表達(dá)下調(diào),在胞核中表達(dá)上調(diào)。結(jié)論1.CDK4過表達(dá)時(shí)p16蛋白在胞漿中表達(dá)上調(diào),而在胞核中表達(dá)下調(diào)。2.CDK4的R24位點(diǎn)突變(CDK4R24C)時(shí)p16蛋白在胞漿中表達(dá)下調(diào),而在胞核中表達(dá)上調(diào)。3.CDK4基因表達(dá)下調(diào)時(shí)p16蛋白在胞漿中表達(dá)下調(diào),而在胞核中表達(dá)上調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2631282