【摘要】：目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一種惡性漿細(xì)胞疾病,發(fā)病率占血液科腫瘤發(fā)病率的10%以上,目前治療手段仍以聯(lián)合化療為主,配合靶向治療及造血干細(xì)胞移植,但是放化療副作用嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量,目前生存期約3-5年,且普遍存在著復(fù)發(fā)耐藥的現(xiàn)象。在腫瘤治療的發(fā)展道路上,化療耐藥仍舊是阻礙其進(jìn)步的絆腳石,在細(xì)胞膜上存在一些可以將化療藥物泵出細(xì)胞外的“泵”,可以將進(jìn)入細(xì)胞的化療藥物泵出細(xì)胞。ABCG2是在研究乳腺癌耐藥細(xì)胞系時(shí)發(fā)現(xiàn)的,后來(lái)發(fā)現(xiàn)它在婦科腫瘤中高表達(dá);消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的腺癌以及白血病等多種腫瘤中均可檢測(cè)到ABCG2的表達(dá)。目前ABCG2已經(jīng)成為耐藥研究的熱點(diǎn),旨在找到逆轉(zhuǎn)耐藥的辦法。目前關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤ABCG2功能的關(guān)鍵問(wèn)題尚未有明確解釋,比如在多發(fā)性骨髓瘤疾病中,ABCG2發(fā)揮怎樣的生物學(xué)功能,是否與疾病的進(jìn)展相關(guān),對(duì)于預(yù)后有怎樣的意義?又比如它與PTEN是否相關(guān)聯(lián)?ABCG2在多發(fā)性骨髓瘤疾病中是否可以發(fā)揮腫瘤保護(hù)作用,抵抗化療藥物帶來(lái)的殺傷?以及ABCG2是否可以作為MM腫瘤干細(xì)胞的表面標(biāo)記?在本文中,我們用Hoechst33342將MM細(xì)胞染色,用流式細(xì)胞儀分選側(cè)群細(xì)胞(side population cell,SP cell),并計(jì)算出SP細(xì)胞所占比例,目的在于鑒定并研究多發(fā)性骨髓瘤側(cè)群細(xì)胞的干細(xì)胞特性,并研究側(cè)群細(xì)胞與相關(guān)信號(hào)通路之間相互調(diào)控關(guān)系。希望可以發(fā)現(xiàn)特異性殺傷SP細(xì)胞的靶點(diǎn),針對(duì)特殊靶點(diǎn)探索出新的治療方案,從而克服傳統(tǒng)化療耐藥,改善MM病人的預(yù)后。我們用過(guò)表達(dá)慢病毒來(lái)提高M(jìn)M細(xì)胞系A(chǔ)BCG2的表達(dá),建立一個(gè)模擬側(cè)群細(xì)胞的模型,并應(yīng)用PI3K/AKT通路抑制劑作用于MM細(xì)胞,分析過(guò)表達(dá)ABCG2前后SP細(xì)胞比例變化情況,接下來(lái)我們觀察了過(guò)表達(dá)ABCG2前后多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)及PTEN/PI3K/AKT這一經(jīng)典信號(hào)通路關(guān)鍵分子的變化情況,用以研究多發(fā)性骨髓瘤耐藥的機(jī)制,并試圖發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn),來(lái)改善多發(fā)性骨髓瘤的治療效果及預(yù)后。我們還利用SiRNA技術(shù)使ABCG2表達(dá)下調(diào),進(jìn)一步了解ABCG2的生物學(xué)功能及其在調(diào)控SP細(xì)胞及PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮的作用。我們還在MM疾病中分析ABCG2與SP細(xì)胞比例及PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路之間的關(guān)系。我們需要解決的問(wèn)題是PI3K/AKT信號(hào)通路以什么形式參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病以及怎樣調(diào)節(jié)耐藥,與ABCG2又存在著什么樣的關(guān)聯(lián),希望找到可行的辦法來(lái)逆轉(zhuǎn)多發(fā)性骨髓瘤的耐藥。方法:1、利用流式細(xì)胞儀分選多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系側(cè)群細(xì)胞,檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中側(cè)群細(xì)胞所占比例。2、分別對(duì)分選出的側(cè)群細(xì)胞(side population cell,SP cell)及主群細(xì)胞(main population cell,MP cell)生物學(xué)特性包括細(xì)胞周期(PI單染法)、細(xì)胞增殖能力(CCK8法)、克隆形成能力(軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn))、藥物敏感型進(jìn)行對(duì)比,并檢測(cè)耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)情況。3、通過(guò)過(guò)表達(dá)慢病毒感染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,使其高表達(dá)耐藥相關(guān)蛋白ABCG2。4、對(duì)比過(guò)表達(dá)前后SP細(xì)胞比例、細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化,并應(yīng)用Real-Time PCR及Western blot檢測(cè)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)變化。5、對(duì)比加入PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑前后,SP細(xì)胞比例、細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性、PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路活性變化情況。6、利用SiRNA干擾多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,使ABCG2表達(dá)下調(diào)。7、對(duì)比干擾前后SP細(xì)胞比例、細(xì)胞增殖速度、細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性、PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路活性變化情況。8、選取臨床明確診斷的MM病人標(biāo)本30例,對(duì)照組10例,流式細(xì)胞儀分選SP細(xì)胞,檢測(cè)臨床病人SP細(xì)胞比例,并分析SP細(xì)胞與病人臨床信息的關(guān)系。9、多發(fā)性骨髓瘤根據(jù)DS分期分組,檢測(cè)組間SP細(xì)胞比例、PTEN、ABCG2及PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)情況及其與疾病進(jìn)展之間的聯(lián)系。結(jié)果:1、在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中可分選出SP細(xì)胞,不同細(xì)胞系SP細(xì)胞比例不同,NCI-H929,U266兩種細(xì)胞系所占比例分別為1.79±0.091%、0.4623±0.0095%。2、檢測(cè)SP及MP細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)與MP細(xì)胞相比,SP細(xì)胞G0/G1期比例明顯升高,即大部分處于相對(duì)靜止期。CCK8法檢測(cè)SP與MP細(xì)胞的相對(duì)增殖能力,發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞具有較快的增殖速度。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的集落形成能力,形成的集落數(shù)量明顯多于MP細(xì)胞。應(yīng)用CCK8法檢測(cè)了SP及MP細(xì)胞對(duì)MM化療藥物的敏感性,發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞相對(duì)不敏感,在相同藥物濃度作用下,SP細(xì)胞死亡率明顯低于MP細(xì)胞,SP細(xì)胞具有較強(qiáng)的對(duì)抗化療藥物的能力。Real-Time PCR檢測(cè)了SP及MP細(xì)胞ABC家族成員表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)ABC家族成員在SP細(xì)胞的表達(dá)情況均明顯高于MP細(xì)胞,尤其是ABCG2,在SP細(xì)胞里表達(dá)比MP細(xì)胞高10余倍。3、過(guò)表達(dá)病毒感染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞后,ABCG2在mRNA及蛋白水平明顯高于未感染細(xì)胞。4、過(guò)表達(dá)ABCG2后,ABCG2 mRNA及蛋白水平表達(dá)明顯升高,細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)性明顯減弱,PTEN蛋白表達(dá)減低,PI3K/AKT通路活性增強(qiáng),SP細(xì)胞比例亦明顯升高。5、過(guò)表達(dá)ABCG2前后的細(xì)胞加入PI3K/AKT通路抑制劑后,發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路活性明顯減弱,ABCG2表達(dá)明顯降低,PTEN蛋白表達(dá)增強(qiáng),SP細(xì)胞比例降低,加入抑制劑后細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性在一定程度上增強(qiáng),表現(xiàn)為細(xì)胞死亡率明顯升高。6、SiRNA干擾可以下調(diào)ABCG2的表達(dá),干擾后的MM細(xì)胞ABCG2在mRNA及蛋白水平表達(dá)明顯降低。7、SiRNA干擾后MM細(xì)胞增殖能力略有減弱,PTEN表達(dá)升高,PI3K/AKT通路活性受到抑制,SP細(xì)胞比例降低,同時(shí)細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)能力增強(qiáng)。8、30例MM病人體內(nèi)均可檢測(cè)到SP細(xì)胞,SP細(xì)胞比例因人而異,范圍0.11-3.73%,發(fā)現(xiàn)MM病人SP細(xì)胞比例與年齡、性別、ISS分期無(wú)關(guān),但與DS分期相關(guān)。9、MM病人與對(duì)照組比較,PTEN mRNA水平降低,ABCG2 mRNA表達(dá)升高,SP細(xì)胞比例與PTEN mRNA水平呈負(fù)相關(guān),而與ABCG2 mRNA水平呈正相關(guān)。按DS分期進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),隨著疾病的進(jìn)展,SP細(xì)胞比例隨疾病進(jìn)展升高,PTEN mRNA水平隨疾病進(jìn)展下降。Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn),PTEN蛋白水平隨疾病進(jìn)展下調(diào),ABCG2蛋白隨著疾病進(jìn)展表達(dá)上調(diào),PI3K/AKT通路的活性也隨著疾病進(jìn)展而增強(qiáng),PTEN蛋白與ABCG2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1、在MM細(xì)胞系中確實(shí)存在SP細(xì)胞,MM的SP細(xì)胞具有“腫瘤干細(xì)胞”樣的生物學(xué)特點(diǎn)。2、在MM中,過(guò)表達(dá)的ABCG2負(fù)反饋調(diào)節(jié)PTEN,上調(diào)PI3K/AKT通路活性及SP比例,使藥物敏感性減低,而通路抑制劑可以抵消過(guò)表達(dá)ABCG2帶來(lái)的腫瘤保護(hù)作用。3、在多發(fā)性骨髓瘤中,ABCG2的下調(diào)可負(fù)反饋上調(diào)PTEN的表達(dá),PI3K/AKT信號(hào)通路受抑,SP比例下調(diào),對(duì)藥物敏感性有所增強(qiáng)。4、在多發(fā)性骨髓瘤病人中存在SP細(xì)胞,SP細(xì)胞所占比例與病人年齡、性別、ISS分期無(wú)關(guān),與DS分期相關(guān)。且隨著DS分期進(jìn)展,SP細(xì)胞比例增加,提示SP細(xì)胞比例與疾病進(jìn)展可能相關(guān)。5、多發(fā)性骨髓瘤病人PTEN表達(dá)減低,ABCG2表達(dá)增高,且隨著疾病進(jìn)展,PTEN遞減,ABCG2遞增,PI3K/AKT通路活性升高,SP比例增加。6、多發(fā)性骨髓瘤中ABCG2負(fù)反饋降低PTEN表達(dá),通過(guò)PI3K/AKT通路發(fā)揮其影響SP細(xì)胞比例的功能。
【圖文】：

多組間比較采用單因素方差分析，兩變量的相關(guān)程度用雙變量相關(guān)分析，p<0.05認(rèn)定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中存在側(cè)群細(xì)胞為了證明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中存在 SP 細(xì)胞并分選出 SP 及 MP 細(xì)胞，我們選擇了兩種 MM 細(xì)胞系（NCI-H929、U266），，通過(guò)流式細(xì)胞儀紫外激發(fā)光進(jìn)行分選（波長(zhǎng) 350nm）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在 MM 細(xì)胞系中確實(shí)有側(cè)群細(xì)胞的存在，但 SP 細(xì)胞所占比例因細(xì)胞系不同而略有差異。在流式散點(diǎn)圖上呈現(xiàn)出低染狀態(tài)，NCI-H929、U266 兩種細(xì)胞系 SP 細(xì)胞所占比例為（1.79±0.091%、0.4623±0.0095%）(圖 3.1)。A B C D

1.85±0.09%、8.94±0.37%；而 U266/MP 細(xì)胞分別為：1.60% 、 40.27 ± 0.41% （圖 3.2 ）。 G0/G1 期所占細(xì)NCI-H929/MP 對(duì)比中，差異具有顯著性（p<0.05）; U26果，G0/G1 期所占細(xì)胞在 U266/SP 及 U266/MP 對(duì)比中，差（圖 3.3）。SP 細(xì)胞大部分處于 G0/G1 期，這與文獻(xiàn)報(bào)道式分選的效率。A B D E
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2630479