【摘要】：【背景】結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床常見的惡性腫瘤,嚴重威脅著人類的健康和生命。目前CRC的病因仍未明確,其可能由于環(huán)境與遺傳因素長期交互作用而誘發(fā)。白細胞分化抗原147(cluster of differentiation 147,CD147),又名細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)、basigin(BSG),是一種廣泛存在于細胞表面的跨膜糖蛋白,參與機體多種生理和病理過程。本課題組前期研究證實CD147在CRC組織和細胞株中表達顯著增高,通過RNA干擾CD147的表達能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移能力,提示CD147在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,然而其詳細的調控機制仍有待深入探討。微小RNA(microRNA,miRNA)是由約22個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA,它通過抑制或降解特定靶基因信使RNA(messenger RNA,mRNA),在轉錄后水平調控基因的表達。鑒于CD147在CRC發(fā)生發(fā)展中的重要作用及miRNA對靶基因的調控作用,我們通過三種預測軟件miRanda,TargetScan和miRDB預測出miR-485-5p可能調控CD147的表達,而miRNA-485-5p在多種腫瘤如口腔鱗狀細胞癌、黑色素瘤、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等中被報道為抗癌基因,但其在結直腸癌中的功能尚未見報道。因此,本研究旨在探討miR-485-5p是否影響結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等及其可能的調控機制�！灸康摹勘狙芯恐荚谔接憁iR-485-5p在結直腸癌中的表達水平及其對結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等表型的影響并驗證CD147是否為miR-485-5p的靶基因�！痉椒ā�1.CD147相互作用miRNAs的篩選:以BSG基因為檢索詞,利用三種預測軟件miRanda,TargetScan和miRDB預測出可能調控CD147的上游miRNA;2.運用實時熒光定量PCR法(realtime fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測miR-485-5p在2種結直腸癌細胞株(DLD-1、SW480)及正常人類腸黏膜上皮細胞(FHC)中的表達,以及該miRNA和CD147在41例CRC組織及對應癌旁組織中的表達水平;3.通過轉染miR-485-5p mimic建立miR-485-5p過表達結直腸癌細胞;4.CCK-8實驗、Transwell實驗及流式細胞術分別檢測miR-485-5p對細胞增殖、遷移和侵襲及凋亡能力的影響;5.建立結直腸癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型,多點注射miR-485-5p agomir及miR-485-5p agomir-NC,觀察過表達miR-485-5p對結直腸癌細胞在裸鼠體內成瘤能力的影響;6.miR-485-5p和CD147在結直腸癌組織中的表達相關性分析采用Spearman相關性分析;7.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、qRT-PCR、Western blot以及挽救實驗驗證miR-485-5p靶向調控CD147�！窘Y果】1.三種預測軟件miRanda,TargetScan和miRDB預測出miR-485-5p可能調控CD147的表達;2.與正常腸粘膜上皮細胞FHC及配對的癌旁組織相比,miR-485-5p在結直腸癌細胞系和組織中低表達,差異有統(tǒng)計學意義;3.轉染miR-485-5p mimic可以顯著上調結直腸癌細胞中miR-485-5p的表達水平;4.實驗性上調miR-485-5p可抑制CRC細胞系的增殖、遷移和侵襲能力,并促進細胞凋亡;5.在裸鼠體內,多點注射miR-485-5p agomir可以抑制結直腸癌細胞SW480的成瘤能力;6.利用Spearman雙變量相關分析,分析結直腸癌組織中miR-485-5p與CD147表達的關系,我們發(fā)現(xiàn)二者的表達呈負相關,表明CD147可能為miR-485-5p的下游靶基因;7.雙熒光素酶報告基因檢測顯示,miR-485-5p過表達可以抑制野生型熒光素酶活性,但對突變型沒有影響,證實miR-485-5p可與CD147的3'端非編碼區(qū)(3’untranslated region,3'UTR)部分結合;轉染miR-485-5p mimic,上調miR-485-5p在結直腸癌細胞中的表達后,qRT-PCR和Western blot均檢測到CD147下調;裸鼠移植瘤免疫組織化學染色結果亦顯示,與miR-485-5p agomir-NC組腫瘤組織中CD147的高表達相比,miR-485-5p agomir組的腫瘤組織中CD147蛋白表達降低。這些發(fā)現(xiàn)均表明CD147和miR-485-5p之間顯著負相關,miR-485-5p可以與CD147 3'UTR區(qū)特異性結合。挽救實驗數(shù)據(jù)表明,過表達CD147可以部分恢復miR-485-5p對結直腸癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學功能的影響�！窘Y論】在結直腸癌中,miR-485-5p發(fā)揮了抑癌基因的功能,可通過CD147抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進細胞凋亡,具有作為基因治療的潛在價值。
【圖文】：

熒光素酶活性檢測們采用碧云天的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，操作取對數(shù)生長期的 293 細胞，接種于 24 孔培養(yǎng)板；待細胞生長密度達到 30%左右，根據(jù) Lipofectamine 2000 試劑說明書進，實驗共分 6 組，分組如下：a. PmirGLO 對照質粒， mimic-NC 共轉染；b. PmirGLO 對照質粒，miR-485-5p mimic 共轉染；圖 1 雙熒光素酶報告基因質粒構建圖注：（a）PmirGLO 報告基因載體圖譜簡圖；（b）生物信息學預測miR-485-5p 3'UTR 結合位點序列及其突變序列

圖注：U6 為內對照，*P<0.01在結直腸癌細胞中低表達測 3 種細胞株中 miR-485-5p 的表達，實驗結果如圖LD-1 和 SW480 中，miR-485-5p 的表達水平均顯著低果相 致，提示 miR-485-5p 的表達下調可能與結RT-PCR 檢測結直腸癌及癌旁組織中 miR-485-5p 的表
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

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1 朱s，

本文編號：2628734