【摘要】：【背景】結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。目前CRC的病因仍未明確,其可能由于環(huán)境與遺傳因素長期交互作用而誘發(fā)。白細(xì)胞分化抗原147(cluster of differentiation 147,CD147),又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)、basigin(BSG),是一種廣泛存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白,參與機(jī)體多種生理和病理過程。本課題組前期研究證實CD147在CRC組織和細(xì)胞株中表達(dá)顯著增高,通過RNA干擾CD147的表達(dá)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力,提示CD147在CRC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,然而其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制仍有待深入探討。微小RNA(microRNA,miRNA)是由約22個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA,它通過抑制或降解特定靶基因信使RNA(messenger RNA,mRNA),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。鑒于CD147在CRC發(fā)生發(fā)展中的重要作用及miRNA對靶基因的調(diào)控作用,我們通過三種預(yù)測軟件miRanda,TargetScan和miRDB預(yù)測出miR-485-5p可能調(diào)控CD147的表達(dá),而miRNA-485-5p在多種腫瘤如口腔鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺腺癌、胃癌、乳腺癌等中被報道為抗癌基因,但其在結(jié)直腸癌中的功能尚未見報道。因此,本研究旨在探討miR-485-5p是否影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等及其可能的調(diào)控機(jī)制�！灸康摹勘狙芯恐荚谔接憁iR-485-5p在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等表型的影響并驗證CD147是否為miR-485-5p的靶基因。【方法】1.CD147相互作用miRNAs的篩選:以BSG基因為檢索詞,利用三種預(yù)測軟件miRanda,TargetScan和miRDB預(yù)測出可能調(diào)控CD147的上游miRNA;2.運用實時熒光定量PCR法(realtime fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測miR-485-5p在2種結(jié)直腸癌細(xì)胞株(DLD-1、SW480)及正常人類腸黏膜上皮細(xì)胞(FHC)中的表達(dá),以及該miRNA和CD147在41例CRC組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平;3.通過轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimic建立miR-485-5p過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞;4.CCK-8實驗、Transwell實驗及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測miR-485-5p對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及凋亡能力的影響;5.建立結(jié)直腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,多點注射miR-485-5p agomir及miR-485-5p agomir-NC,觀察過表達(dá)miR-485-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響;6.miR-485-5p和CD147在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析;7.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、qRT-PCR、Western blot以及挽救實驗驗證miR-485-5p靶向調(diào)控CD147�！窘Y(jié)果】1.三種預(yù)測軟件miRanda,TargetScan和miRDB預(yù)測出miR-485-5p可能調(diào)控CD147的表達(dá);2.與正常腸粘膜上皮細(xì)胞FHC及配對的癌旁組織相比,miR-485-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織中低表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義;3.轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimic可以顯著上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)水平;4.實驗性上調(diào)miR-485-5p可抑制CRC細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;5.在裸鼠體內(nèi),多點注射miR-485-5p agomir可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的成瘤能力;6.利用Spearman雙變量相關(guān)分析,分析結(jié)直腸癌組織中miR-485-5p與CD147表達(dá)的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),表明CD147可能為miR-485-5p的下游靶基因;7.雙熒光素酶報告基因檢測顯示,miR-485-5p過表達(dá)可以抑制野生型熒光素酶活性,但對突變型沒有影響,證實miR-485-5p可與CD147的3'端非編碼區(qū)(3’untranslated region,3'UTR)部分結(jié)合;轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimic,上調(diào)miR-485-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)后,qRT-PCR和Western blot均檢測到CD147下調(diào);裸鼠移植瘤免疫組織化學(xué)染色結(jié)果亦顯示,與miR-485-5p agomir-NC組腫瘤組織中CD147的高表達(dá)相比,miR-485-5p agomir組的腫瘤組織中CD147蛋白表達(dá)降低。這些發(fā)現(xiàn)均表明CD147和miR-485-5p之間顯著負(fù)相關(guān),miR-485-5p可以與CD147 3'UTR區(qū)特異性結(jié)合。挽救實驗數(shù)據(jù)表明,過表達(dá)CD147可以部分恢復(fù)miR-485-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學(xué)功能的影響。【結(jié)論】在結(jié)直腸癌中,miR-485-5p發(fā)揮了抑癌基因的功能,可通過CD147抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,具有作為基因治療的潛在價值。
【圖文】：

熒光素酶活性檢測們采用碧云天的雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，操作取對數(shù)生長期的 293 細(xì)胞，接種于 24 孔培養(yǎng)板；待細(xì)胞生長密度達(dá)到 30%左右，根據(jù) Lipofectamine 2000 試劑說明書進(jìn)，實驗共分 6 組，分組如下：a. PmirGLO 對照質(zhì)粒， mimic-NC 共轉(zhuǎn)染；b. PmirGLO 對照質(zhì)粒，miR-485-5p mimic 共轉(zhuǎn)染；圖 1 雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建圖注：（a）PmirGLO 報告基因載體圖譜簡圖；（b）生物信息學(xué)預(yù)測miR-485-5p 3'UTR 結(jié)合位點序列及其突變序列

圖注：U6 為內(nèi)對照，*P<0.01在結(jié)直腸癌細(xì)胞中低表達(dá)測 3 種細(xì)胞株中 miR-485-5p 的表達(dá)，實驗結(jié)果如圖LD-1 和 SW480 中，miR-485-5p 的表達(dá)水平均顯著低果相 致，提示 miR-485-5p 的表達(dá)下調(diào)可能與結(jié)RT-PCR 檢測結(jié)直腸癌及癌旁組織中 miR-485-5p 的表
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

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