【摘要】：第一部分:miR-29s家族在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義研究研究背景和目的肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,全世界范圍的發(fā)病率居于惡性腫瘤的第五位,死亡率居第三位。肝癌在早期難以發(fā)現(xiàn)和診斷且預(yù)后極差,因此,尋找可靠、有效的分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后對(duì)改善肝癌患者的不良預(yù)后具有重要的意義。MiRNAs是一種小分子非編碼RNA,具有調(diào)控基因表達(dá)的功能,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)除了參與細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程外,miRNAs還可以作為腫瘤生物標(biāo)志物來(lái)判斷腫瘤患者的預(yù)后。MiR-29s家族主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c三種miRNAs,很多研究發(fā)現(xiàn)miR-29s家族與多種癌癥密切相關(guān),但miR-29s家族是否能作為標(biāo)志物來(lái)判斷肝癌患者的預(yù)后還不明確,因此,本研究旨在檢測(cè)miR-29s家族在肝癌組織中的表達(dá)和評(píng)估其在臨床上作為肝癌預(yù)后判斷標(biāo)志物的有效性。研究方法①研究對(duì)象:選取2008年到2015年在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院實(shí)行肝切除術(shù)的122例肝細(xì)胞癌患者為研究對(duì)象:經(jīng)病史詢問(wèn)和全身體格檢查后,采集患者的靜脈血進(jìn)行肝功能檢測(cè)和腫瘤標(biāo)志物檢測(cè);CT和MRI檢查評(píng)估患者TNM分期;進(jìn)行肝切除術(shù),記錄腫瘤直徑、位置以及剩余肝臟大小,肝切除術(shù)遵循Couinaud肝段劃分法。②手術(shù)標(biāo)本保存:手術(shù)后立即將肝癌組織及癌旁組織置于液氮中,隨后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中儲(chǔ)存或者制成石蠟組織標(biāo)本。③組織RNA提取和miRNA定量檢測(cè):組織RNA提取采用酚-氯仿法;采用miRNA試劑盒擴(kuò)增miRNA并在ABI 7300系統(tǒng)上進(jìn)行定量檢測(cè)。④隨訪:隨訪過(guò)程中每個(gè)月檢測(cè)血清甲胎蛋白(AFP)水平以及腹部B超檢查,術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月進(jìn)行腹部CT和MRI檢查,2年后每6個(gè)月進(jìn)行腹部CT和MRI檢查。生存時(shí)間定義為術(shù)后到死亡或者最后一次隨訪之間的時(shí)間。⑤對(duì)miRNA的檢測(cè)結(jié)果以及其他臨床病理特征進(jìn)行COX比例風(fēng)險(xiǎn)分析來(lái)探討影響肝癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。研究結(jié)果①研究對(duì)象的中位隨訪時(shí)間為6.5年(6.2月～8.2年),122例肝癌患者中,男女比例為2.49:1,腫瘤直徑≤5cm的比例為63.1%,微血管浸潤(rùn)的比例為62.3%,單發(fā)腫瘤的比例為81.1%,miR-29a、miR-29b和miR-29c低表達(dá)的比例分別為 42.6%、78.7%和 35.3%。②與癌旁組織相比,肝癌組織中miR-29a、miR-29b和miR-29c表達(dá)均降低(P0.001)。⑤122例肝癌患者1年、3年和5年總生存率分別為87.5%、53.3%和44.1%,生存統(tǒng)計(jì)和Kaplan-Meier曲線表明AFP400ng/ml(P=0.004)、腫瘤直徑5cm(P=0.002)、微血管浸潤(rùn)(P=0.011)、多發(fā)性腫瘤(P=0.007)、miR-29b和miR-29c的共同低表達(dá)(P=0.012)與患者預(yù)后有關(guān),miR-29a與預(yù)后無(wú)明顯相關(guān)。④AFP400ng/ml與5年總生存率從53.4%下降到28.6%有關(guān)(P=0.010);腫瘤直徑5cm與5年總生存率從53.1%下降到28.6%有關(guān)(P0.001);微血管浸潤(rùn)與5年總生存率從57.1%到34.4%有關(guān)(P=0.009);多發(fā)腫瘤與5年總生存率從48.7%下降到24.8%有關(guān)(P=0.036);miR-29b的低表達(dá)與5年總生存率從70.2%下降到39.1%有關(guān)(P=0.020);miR-29c的低表達(dá)與5年總生存率從53.6%下降到23.7%有關(guān)(P=0.012);miR-29b與miR-29c的共同低表達(dá)與5年總生存率從51.7%下降到30.5%有關(guān)(P=0.006)。⑤COX比例風(fēng)險(xiǎn)分析也顯示AFP400ng/ml、腫瘤直徑5cm、微血管浸潤(rùn)、多發(fā)性腫瘤以及miR-29b與miR-29c的共同低表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān);miR-29b與miR-29c的共同低表達(dá)是肝癌患者預(yù)后判斷的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(HR=2.561,P=0.012)。研究結(jié)論①M(fèi)iR-29a、miR-29b和miR-29c在肝癌組織中表達(dá)降低。②AFP400ng/ml、腫瘤直徑5cm、微血管浸潤(rùn)、多發(fā)性腫瘤以及miR-29b與miR-29c的共同低表達(dá)與肝癌患者生存率降低有關(guān),且miR-29b與miR-29c的共同低表達(dá)是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。第二部分:miR-29s家族對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的實(shí)驗(yàn)研究研究背景和目的肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,原發(fā)性肝癌的分子機(jī)制研究是目前的研究熱點(diǎn)。在第一部分研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-29s家族中miR-29b與miR-29c的共同低表達(dá)是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素,但miR-29s家族對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和凋亡的作用及機(jī)制還不明確,因此,本研究旨在探討miR-29s家族對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。研究方法①體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株L02和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721,用RT-qPCR法檢測(cè)miR-29a、miR-29b和miR-29c在正常肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)。②在SMMC-7721細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-29a、miR-29b和miR-29c mimics來(lái)提高三個(gè)miRNAs在肝癌細(xì)胞中的表達(dá),用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力;采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。③檢索miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-29a、miR-29b和miR-29c的靶基因,繪制韋恩圖來(lái)觀察三個(gè)miRNAs預(yù)測(cè)到的靶基因的差異,同時(shí)利用Metascape軟件進(jìn)行靶基因的KEGG pathway分析。④轉(zhuǎn)染 mimics 后用 western blot 檢測(cè) CDK2、CDK6、AKT2、Bcl-2 和 Bax 蛋白的表達(dá)變化。研究結(jié)果①與正常人肝細(xì)胞相比,miR-29a、miR-29b和miR-29c在肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低。②在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNAs模擬體分別過(guò)表達(dá)miR-29a、miR-29b和miR-29c后,細(xì)胞的增殖活力均受到抑制;肝癌細(xì)胞的克隆形成能力降低;細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。⑤miR-29a、miR-29b和miR-29c預(yù)測(cè)到的靶基因數(shù)目均為632個(gè),且三個(gè)miRNAs共同預(yù)測(cè)到的靶基因數(shù)目為631個(gè);與預(yù)測(cè)到的靶基因相關(guān)的KEGG信號(hào)通路排名前五的分別為 protein digestion and absorption、small cell lung cancer、TNF signaling pathway、Toxoplasmosis 和 mTOR signaling pathway。④肝癌細(xì)胞中miR-29a、miR-29b和miR-29c的過(guò)表達(dá)均抑制了 CDK2、CDK6、AKT2以及Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)了 Bax的表達(dá)。研究結(jié)論①M(fèi)iR-29s家族在肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低。②MiR-29s家族抑制了肝癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡。③CDK2、CDK6和AKT2均是miR-29s家族的靶基因,miR-29s家族可能是通過(guò)抑制這些基因的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的。
【圖文】：

與５年總生存率從５３．６％下降到２３．７％有關(guān)（Ｐ＝０．Ｗ２）邋；邋ｍｉＲ－２９ｂ與ｍｉＲ－２９ｃ逡逑的共同低表達(dá)與５年總生存率從５１．７％下降到３０．５％有關(guān)㈨＜５），具體見逡逑表２和圖２。逡逑表２生存資料分析逡逑Ｔａｂｌｅ邋２邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｄａｔａ逡逑１－ｙｅａｒ邋ＯＳ邐３－ｙｅａｒ邋ＯＳ邐５－ｙｅａｒ邋ＯＳ逡逑Ｖａｒｉａｂｌｅｓ邐ｐｅｒｃｅｎｔ邐ｐｅｒｃｅｎｔ邐ｐｅｒｃｅｎｔ邐逡逑Ｏｖｅｒａｌｌ邐８７．５邐５３．３邐４４．１逡逑ＡＦＰ（ｎｇ／ｍＩ）逡逑＜４００邐９０．３邐６３．４邐５３．４逡逑＞４００邐８４．５邐４４．４邐３４．３逡逑Ｍｅｄｉａｎ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ逡逑＜５ｃｍ邐９６．１邐６３．１邐５３．１逡逑＞邋５ｃｍ邐７２．４邐３６．３邐２８．６逡逑Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ邋ｉｎｖａｓｉｏｎ逡逑Ｙｅｓ邐９５．５邐６５．６邐５７．１逡逑Ｎｏ邐８０．１邐４５．９邐３４．４逡逑Ｔｕｍｏｒ邋ｎｕｍｂｅｒ逡逑Ｓｏｌｉｔａｒｙ邐８８．７邐５６．５邐４８．７逡逑Ｍｕｌｔｉｐｌｅ邐７８．１邐３９．７邐２４．８逡逑ＭｉＲＮＡ－２９ａ逡逑Ｈｉｇｈ邐７８．６邐５２．６邐４６．９逡逑Ｌｏｗ邐６８．４邐５０．４邐４１

ｍｉＲ－２９ｂ和ｍｉＲ－２９ｃ，分別轉(zhuǎn)染２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ和９６ｈ后用ＭＴＳ檢測(cè)細(xì)胞的增逡逑殖活力，發(fā)現(xiàn)ｍｉＲＮＡ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ和ｍｉＲ－２９ｃ的過(guò)表達(dá)均抑制了邋ＳＭＭＣ－７７２１逡逑細(xì)胞的增殖活力，并且三者之間無(wú)明顯差別，，具體見圖２。逡逑ｍｉＲ－２９ａ逡逑１．５－ｊ邐ｍｉＲ－２９ｂ逡逑十邋ｍｉＲ－２９ｃ邐ｘ逡逑＋邋ＮＣ逡逑Ｅ邋１邐ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑§。５邋＊逡逑0？0邐ｉ邐ｉ邐＿邐ｉ逡逑２４ｈ邐４８ｈ邐７２ｈ邐９６ｈ逡逑圖２邋ｍｉＲ－２９ｓ家族的過(guò)表達(dá)降低了肝癌細(xì)胞的增殖活力逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－２９ｓ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＨＣＣ逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2628497