【摘要】：1965年Lauren在胃癌的組織細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,將胃癌分成兩種類型:腸型和彌漫型。兩種類型的胃癌在大體形態(tài)、病理類型、來源、分化程度和細(xì)胞形態(tài)等方面均有不同。腸型胃癌大體形態(tài)為蕈傘型,病理類型包括乳頭狀和管狀腺癌,此類型胃癌起源于腸上皮化生,癌細(xì)胞為分化程度較好、游離緣�？梢娝罹壍闹鶢罨蛄⒎叫�,類似于腸上皮的吸收細(xì)胞,部分細(xì)胞則類似于腸化生的杯狀細(xì)胞,有腺腔形成,癌旁黏膜常伴有廣泛的腸上皮化生和萎縮性胃炎。而彌漫型胃癌大體形態(tài)為潰瘍型和彌漫浸潤(rùn)型,病理類型包括未分化癌和黏液癌,此類型胃癌起源于胃固有膜,癌細(xì)胞為分化程度較差、散在彌漫的小圓形細(xì)胞,無腺腔形成,癌旁黏膜無或僅有小片腸上皮化生和萎縮性胃炎。腸型胃癌和彌漫型胃癌發(fā)病原理和轉(zhuǎn)移機(jī)制各不相同。闡明各自發(fā)生發(fā)展的具體分子途徑對(duì)精準(zhǔn)治療、控制病情和提高預(yù)后具有重要意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),即失去上皮標(biāo)記物E-cadherin,同時(shí)獲得間質(zhì)標(biāo)記物N-cadherin、Fironectin和Vimentin表達(dá)。EMT在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。能量代謝的重排是腫瘤的第七標(biāo)記,腫瘤細(xì)胞最具特征的表型是Warburg效應(yīng),即腫瘤細(xì)胞即使在氧豐富情況下通過糖酵解而不是氧化磷酸化獲得能量。丙酮酸脫氫酶激酶(Pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)是丙酮酸脫氫酶抑制劑,通過增強(qiáng)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸促進(jìn)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移[1]。因?yàn)槌浞掷肳arburg效應(yīng)降低腫瘤微環(huán)境乳酸對(duì)抑制腫瘤發(fā)展很重要,闡明乳酸上下游信號(hào)通路的驅(qū)動(dòng)基因?qū)_治療是十分必要的。乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDH-A)是催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的限速酶。Sonveaux發(fā)現(xiàn)乳酸是無氧酵解和氧合腫瘤細(xì)胞能量代謝共生關(guān)系的紐帶,抑制乳酸生成可以選擇性殺死以乳酸提供能量的乏氧腫瘤細(xì)胞[2]。鑒于低氧是重要的胃癌EMT誘導(dǎo)因子[3-7],我們預(yù)測(cè)在惡性腫瘤中沉默LDH-A可以下調(diào)EMT,并通過檢測(cè)EMT相關(guān)因子Snail、ZEB1、ZEB2、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)篩選出變化最顯著的因子。第一部分LDH-A通過上調(diào)ZEB2促進(jìn)腸型胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移目的:體外研究LDH-A是否促進(jìn)腸型胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移及其發(fā)生機(jī)制。方法:A.采用Westernblot方法從人腸型胃癌細(xì)胞株MKN28、SGC7901、BGC823和人永生化胃粘膜上皮細(xì)胞株GES中篩選出LDH-A表達(dá)較高的兩個(gè)細(xì)胞株。B.LDH-A干擾序列siRNA376、siRNA506和siRNA980分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染經(jīng)上步驟篩選的兩個(gè)細(xì)胞株,Westernblot方法分別篩選出對(duì)LDH-A干擾效果最佳者。C.篩選出來的干擾序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LDH-A高表達(dá)的兩個(gè)細(xì)胞株,48小時(shí)提取RNA,檢測(cè)EMT標(biāo)記物的表達(dá)變化。D.Wsternblot方法檢測(cè)經(jīng)Real-time RT-PCR方法篩選出的mRNA有顯著變化的基因在蛋白水平的表達(dá)。E.侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)篩選出來的干擾序列瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LDH-A高表達(dá)的兩個(gè)細(xì)胞株后侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果:A.與人永生化胃粘膜上皮細(xì)胞株GES相比,人腸型胃癌細(xì)胞株SGC7901和BGC823中LDH-A蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。B.Westernblot結(jié)果顯示siRNA376在BGC823和SGC7901中抑制效果均最好,因此選擇干擾序列siRNA376進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。C.siRNA376瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞,Real-time RT-PCR結(jié)果顯示LDH-A敲除顯著下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物ZEB2和Vimentin(P0.001),而上皮標(biāo)記物E-cadherin明顯上調(diào)(P0.001),Snail、ZEB1 和 N-cadherin 表達(dá)無明顯改變(P0.05)。Westernblot 結(jié)果證實(shí)在蛋白水平ZEB2和Vimentin的下調(diào)和E-cadherin的上調(diào)。D.siRNA376瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞,Real-time RT-PCR結(jié)果顯示LDH-A敲除顯著下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物 ZEB2、Vimentin(P0.001)和 Fibronectin(P0.01),而 E-cadherin 明顯上調(diào)(P0.001)。Westemblot結(jié)果證實(shí)在蛋白水平ZEB2和Vimentin的下調(diào)和E-cadherin的上調(diào)。E.LDH-A敲除明顯降低SGC7901和BGC823浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:LDH-A通過上調(diào)ZEB2促進(jìn)EMT而加速腸型胃癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,提示LDH-A/ZEB2與腸型胃癌預(yù)后可能存在相關(guān)性。第二部分LDH-A/ZEB2和腸型胃癌預(yù)后相關(guān)性分析目的:通過免疫組化研究LDH-A表達(dá)與ZEB2、Vimentin表達(dá)和臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;通過單因素生存分析研究LDH-A和ZEB2聯(lián)合表達(dá)與腸型胃癌預(yù)后的相關(guān)性。方法:371例腸型胃癌均有相對(duì)應(yīng)的癌旁正常胃組織標(biāo)本,并且均有完整的臨床和5年隨訪資料,終末隨訪時(shí)間2010年3月。我們采用免疫組化方法檢測(cè)LDH-A和ZEB2的表達(dá),分別比較二者在腸型胃癌及其對(duì)應(yīng)癌旁正常胃組織表達(dá)的差異,并研究LDH-A與臨床病理資料的相關(guān)性,結(jié)合隨訪資料進(jìn)一步進(jìn)行生存分析。結(jié)果:A.免疫組化結(jié)果顯示:與癌旁正常組織相比,LDH-A和ZEB2在腸型胃癌的高表達(dá)率顯著升高(P0.001)。B.LDH-A在腸型胃癌中的高表達(dá)與ZEB2(P=0.003)、Vimentin(P=0.024)、浸潤(rùn)深度(P0.001)和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P0.001)顯著相關(guān)。而與其他臨床病理參數(shù)如年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無明顯相關(guān)。C.單因素生存分析顯示:LDH-A高表達(dá)患者5年總生存較LDH-A低表達(dá)患者降低(P0.001,log-rank檢驗(yàn))。ZEB2高表達(dá)患者5年總生存較ZEB2低表達(dá)患者降低(P0.001,log-rank檢驗(yàn))。LDH-A和ZEB2聯(lián)合表達(dá)較單一表達(dá)預(yù)后差(P0.001,log-rank檢驗(yàn))。4.多因素分析顯示:ZEB2高表達(dá)是總生存(P=0.003)獨(dú)立的預(yù)后因素。結(jié)論:LDH-A表達(dá)與ZEB2表達(dá)呈正相關(guān),LDH-A和ZEB2聯(lián)合表達(dá)較單一表達(dá)預(yù)后差,LDH-A與ZEB2相關(guān)性為改善腸型胃癌預(yù)后提供治療策略。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：2626186