【摘要】：[目的]胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率與死亡率均居消化系統(tǒng)腫瘤第一位。課題組前期通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選得到胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)絲氨酸蛋白酶1(PRSS1),并證實(shí)其在胃癌組織中高表達(dá)。本研究觀察PRSS1低表達(dá)對胃癌MGC803細(xì)胞增殖的影響,并探究其作用機(jī)制。[方法]1.運(yùn)用免疫組織化學(xué)及及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測胃癌組織芯片及MGC803細(xì)胞中PAR-2蛋白表達(dá)情況;2.將pc DNA6.2?-GW/Em GFP-mi R-PRSS1熒光干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MGC803細(xì)胞,建立PRSS1低表達(dá)MGC803細(xì)胞,采用MTT比色法和平皿克隆形成實(shí)驗(yàn),觀察PRSS1低表達(dá)對MGC803細(xì)胞增殖的影響;3.運(yùn)用FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)與SLIGKV-NH2(PAR-2激動(dòng)劑)分別孵育未處理MGC803細(xì)胞及PRSS1低表達(dá)MGC803細(xì)胞,探究PAR-2活性改變對MGC803細(xì)胞增殖的影響;4.采用Western blot檢測PRSS1與PAR-2表達(dá)改變后,MGC803細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化情況,分析ERK信號(hào)通路在MGC803細(xì)胞增殖中的作用。[結(jié)果]1.PAR-2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,其在正常胃粘膜組織、高分化、中分化、低分化胃腺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達(dá)率分別為22.03%、75.00%、89.66%、94.23%和94.34%。PAR-2在高分化、中分化、低分化胃腺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中表達(dá)高于正常胃粘膜組織(P=0.0418)。胃癌組織中PAR-2表達(dá)與腫瘤TNM分期(P=0.0001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.0122)。PAR-2在MGC803細(xì)胞中表達(dá)高于永生化胃上皮GES-1細(xì)胞。2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRSS1低表達(dá)與FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)孵育后,MGC803細(xì)胞均出現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象(P0.05)。SLIGKV-NH2(PAR-2激動(dòng)劑)孵育后,PRSS1低表達(dá)MGC803細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象完全恢復(fù)(P0.05)。3.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRSS1低表達(dá)與FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)孵育后,MGC803細(xì)胞克隆形成能力均受抑制(P0.001)。SLIGKV-NH2(PAR-2激動(dòng)劑)孵育后,PRSS1低表達(dá)MGC803細(xì)胞克隆形成能力完全恢復(fù)(P0.001)。4.PRSS1低表達(dá)及FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)孵育后,MGC803細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平下降(P0.01),抑制ERK信號(hào)通路活化。SLIGKV-NH2(PAR-2激動(dòng)劑)孵育后,PRSS1低表達(dá)MGC803細(xì)胞中磷酸化ERK1/2表達(dá)增加(P0.05)。[結(jié)論]1.PAR-2在胃癌組織高表達(dá),其表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.PRSS1低表達(dá)降低PAR-2活化,阻礙ERK信號(hào)通路激活,抑制胃癌MGC803細(xì)胞增殖。
【圖文】：

圖 3.1 免疫組織化學(xué)染色觀察 PAR-2 在胃癌組織中的表達(dá)A：正常胃粘膜組織；B：高分化腺癌組織；C：中分化腺癌組織；D：低分化腺癌組織；E：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織。A-E：4×放大；A1-E1：10×放大；A2-E2：40×放大。表 3.1 PAR-2 在胃癌組織中的表達(dá)統(tǒng)計(jì)組織類型 例數(shù)（n）免疫組化結(jié)果（n）PAR-2 陽性率（%）陰性（-）弱陽性（+）中度陽性（++）強(qiáng)陽性（+++）正常胃粘膜組織59 46 6 5 2 22.03高分化腺癌組織8 2 1 3 2 75.00*中分化腺癌組織29 3 4 5 17 89.66*

為進(jìn)一步驗(yàn)證 Western blot 結(jié)果，，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，檢測 MGC803 細(xì)胞中PAR-2 蛋白表達(dá)情況，并以永生化胃上皮 GES-1 細(xì)胞作對照。結(jié)果顯示，MGC803 細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中存在PAR-2表達(dá)，而GES-1細(xì)胞內(nèi)未見表達(dá)（見圖3.3）。結(jié)果與Westernblot 結(jié)果基本一致。圖 3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察 PAR-2 在 MGC803 及 GES-1 細(xì)胞中的表達(dá)A：MGC803 細(xì)胞；B：GES-1 細(xì)胞。A-B：10×放大；A1-B1：40×放大。3.2 建立 PRSS1 低表達(dá) MGC803 細(xì)胞3.2.1 pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR-PRSS1 干擾載體的測序鑒定將 pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR-PRSS1 熒光干擾質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài) JM109 大腸桿菌，氨芐青霉素篩選，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序（見圖 3.4A、B）。測序結(jié)果經(jīng) BLAST 分析，確認(rèn)干擾質(zhì)粒中包含完整 PRSS1 干擾序列（見圖 3.4 C），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。A A1B B1
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2626045