發(fā)布時間：2020-04-13 13:21

【摘要】：[目的]胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率與死亡率均居消化系統(tǒng)腫瘤第一位。課題組前期通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選得到胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)絲氨酸蛋白酶1(PRSS1),并證實其在胃癌組織中高表達。本研究觀察PRSS1低表達對胃癌MGC803細胞增殖的影響,并探究其作用機制。[方法]1.運用免疫組織化學(xué)及及免疫細胞化學(xué)檢測胃癌組織芯片及MGC803細胞中PAR-2蛋白表達情況;2.將pc DNA6.2?-GW/Em GFP-mi R-PRSS1熒光干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MGC803細胞,建立PRSS1低表達MGC803細胞,采用MTT比色法和平皿克隆形成實驗,觀察PRSS1低表達對MGC803細胞增殖的影響;3.運用FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)與SLIGKV-NH2(PAR-2激動劑)分別孵育未處理MGC803細胞及PRSS1低表達MGC803細胞,探究PAR-2活性改變對MGC803細胞增殖的影響;4.采用Western blot檢測PRSS1與PAR-2表達改變后,MGC803細胞內(nèi)ERK1/2磷酸化情況,分析ERK信號通路在MGC803細胞增殖中的作用。[結(jié)果]1.PAR-2蛋白主要表達于細胞膜和細胞漿,其在正常胃粘膜組織、高分化、中分化、低分化胃腺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達率分別為22.03%、75.00%、89.66%、94.23%和94.34%。PAR-2在高分化、中分化、低分化胃腺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中表達高于正常胃粘膜組織(P=0.0418)。胃癌組織中PAR-2表達與腫瘤TNM分期(P=0.0001)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.0122)。PAR-2在MGC803細胞中表達高于永生化胃上皮GES-1細胞。2.MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRSS1低表達與FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)孵育后,MGC803細胞均出現(xiàn)增殖抑制現(xiàn)象(P0.05)。SLIGKV-NH2(PAR-2激動劑)孵育后,PRSS1低表達MGC803細胞增殖抑制現(xiàn)象完全恢復(fù)(P0.05)。3.克隆形成實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRSS1低表達與FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)孵育后,MGC803細胞克隆形成能力均受抑制(P0.001)。SLIGKV-NH2(PAR-2激動劑)孵育后,PRSS1低表達MGC803細胞克隆形成能力完全恢復(fù)(P0.001)。4.PRSS1低表達及FSLLRY-NH2(PAR-2抑制劑)孵育后,MGC803細胞中ERK1/2磷酸化水平下降(P0.01),抑制ERK信號通路活化。SLIGKV-NH2(PAR-2激動劑)孵育后,PRSS1低表達MGC803細胞中磷酸化ERK1/2表達增加(P0.05)。[結(jié)論]1.PAR-2在胃癌組織高表達,其表達與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.PRSS1低表達降低PAR-2活化,阻礙ERK信號通路激活,抑制胃癌MGC803細胞增殖。
【圖文】：

圖 3.1 免疫組織化學(xué)染色觀察 PAR-2 在胃癌組織中的表達A：正常胃粘膜組織；B：高分化腺癌組織；C：中分化腺癌組織；D：低分化腺癌組織；E：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織。A-E：4×放大；A1-E1：10×放大；A2-E2：40×放大。表 3.1 PAR-2 在胃癌組織中的表達統(tǒng)計組織類型 例數(shù)（n）免疫組化結(jié)果（n）PAR-2 陽性率（%）陰性（-）弱陽性（+）中度陽性（++）強陽性（+++）正常胃粘膜組織59 46 6 5 2 22.03高分化腺癌組織8 2 1 3 2 75.00*中分化腺癌組織29 3 4 5 17 89.66*

為進一步驗證 Western blot 結(jié)果，，采用免疫細胞化學(xué)染色，檢測 MGC803 細胞中PAR-2 蛋白表達情況，并以永生化胃上皮 GES-1 細胞作對照。結(jié)果顯示，MGC803 細胞膜與細胞漿中存在PAR-2表達，而GES-1細胞內(nèi)未見表達（見圖3.3）。結(jié)果與Westernblot 結(jié)果基本一致。圖 3.3 免疫細胞化學(xué)染色觀察 PAR-2 在 MGC803 及 GES-1 細胞中的表達A：MGC803 細胞；B：GES-1 細胞。A-B：10×放大；A1-B1：40×放大。3.2 建立 PRSS1 低表達 MGC803 細胞3.2.1 pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR-PRSS1 干擾載體的測序鑒定將 pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR-PRSS1 熒光干擾質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài) JM109 大腸桿菌，氨芐青霉素篩選，擴增后抽提質(zhì)粒，送上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序（見圖 3.4A、B）。測序結(jié)果經(jīng) BLAST 分析，確認干擾質(zhì)粒中包含完整 PRSS1 干擾序列（見圖 3.4 C），可用于后續(xù)實驗。A A1B B1
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 靳斌;王新;靳雁;陳崢;吳開春;樊代明;;一種靈敏簡便的酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測胃癌血清MG7抗原[J];中華消化雜志;2016年03期

2 Mitsuro Kanda;Yasuhiro Kodera;;Recent advances in the molecular diagnostics of gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2015年34期

3 Bhawna Bagaria;Sadhna Sood;Rameshwaram Sharma;Soniya Lalwani;;Comparative study of CEA and CA19-9 in esophageal,gastric and colon cancers individually and in combination(ROC curve analysis)[J];Cancer Biology & Medicine;2013年03期

4 張成;高廣榮;李達;呂晨光;蔣會勇;李瑾;張雪峰;;PAR-2、VEGF和CD34在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2013年11期

5 張成;高廣榮;李達;蔣會勇;李瑾;張雪峰;;PAR-2、EGFR和Ki67在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年04期

6 李俊;楊斌;郭瑜;鄭啟昌;彭滔;柯文波;張磊;熊俊;;營養(yǎng)剝奪通過誘導(dǎo)自噬促進肝癌細胞侵襲[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年05期

7 于穎彥;朱正綱;;2010版WHO胃腫瘤臨床病理學(xué)分類及分期解讀[J];外科理論與實踐;2011年05期

8 許良中，楊文濤;免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標準[J];中國癌癥雜志;1996年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 譚招麗;西妥昔單抗治療mCRC耐藥機制的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2017年

2 張志偉;胃粘膜上皮癌變相關(guān)蛋白質(zhì)分子的篩選與鑒定[D];南華大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 鄧南星;沉默PRSS1對胃癌MGC803細胞遷移侵襲的影響[D];南華大學(xué);2015年

2 段澤星;蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2626045