【摘要】：背景原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,患者的預(yù)后較差,完全切除術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高。有部分肝癌患者在腫瘤切除術(shù)后,3個(gè)月內(nèi)腫瘤再次復(fù)發(fā),這種復(fù)發(fā)病人預(yù)后差,我們稱之為早期復(fù)發(fā)。這可能是因?yàn)槲覀儗?duì)肝癌的發(fā)生,發(fā)展機(jī)制了解較少。然而,隨著測(cè)序技術(shù)的突破性進(jìn)展,非編碼RNA在肝癌中的異常表達(dá),已經(jīng)證明是影響HCC的重要因素。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding,lnc RNA)是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,基本不具有轉(zhuǎn)錄,編碼蛋白質(zhì)的功能,然而現(xiàn)在肝癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)lnc RNA異常表達(dá),lnc RNA在腫瘤的生長(zhǎng),繁殖過(guò)程中可能起到重要的作用。目前l(fā)nc RNA在肝癌中的研究仍較少,且大部分lnc RNA調(diào)控機(jī)制,具體功能仍然不是很清楚,因此有尋找與肝癌相關(guān)異常表達(dá)的lnc RNA是極其重要的。本課題組應(yīng)用RNA-Seq檢測(cè)患者術(shù)后3個(gè)月內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)的肝癌組織和大于3年沒有復(fù)發(fā)的患者肝癌組織lnc RNA表達(dá)譜的差異,通過(guò)生物信息學(xué)篩選出與肝癌相關(guān)的lnc RNA,并進(jìn)行功能和機(jī)制研究。目的本課題組通過(guò)RNA-Seq技術(shù)HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)病人腫瘤組織中篩選出有著顯著差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,探討該長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肝癌早期復(fù)發(fā)中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制。方法1、利用RNA-Seq技術(shù)檢測(cè)3例3個(gè)月內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)的肝癌組織和大于3年沒有復(fù)發(fā)的患者肝癌組織lnc RNA表達(dá)譜的差異,從表達(dá)水平、lnc RNA長(zhǎng)度、數(shù)據(jù)庫(kù)完整lnc RNA序列、GO富集及KEGG pathway分析等方面篩選與肝癌相關(guān)的差異表達(dá)的lnc RNA,利用實(shí)時(shí)定量PCR(q RT-PCR)在肝癌細(xì)胞系和組織中驗(yàn)證部分差異表達(dá)的lnc RNA,最后確定SNHG16為后續(xù)研究對(duì)象。2、FISH實(shí)驗(yàn)定位SNHG16在細(xì)胞中的表達(dá)位置3、收集20例行肝癌切除術(shù)患者的早期復(fù)發(fā)的肝癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織,采用q RT-PCR方法檢測(cè)SNHG16的表達(dá)情況。4、收集102例行肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織分析SNHG16表達(dá)情況與患者臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。5、SNHG16靶基因的預(yù)測(cè)、驗(yàn)證及功能研究:結(jié)合基因定位分析和生物信息預(yù)測(cè),推測(cè)SNHG16可能與mi R-17-5p競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)P62,并采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告驗(yàn)證P62,mi R-17-5p與SNHG16之間的關(guān)系。6、SNHG16調(diào)控的分子機(jī)制研究:利用q RT-PCR、Western-blot、檢測(cè)m TOR通路。結(jié)果1、與3年沒復(fù)發(fā)的腫瘤組織相比,選取在3月內(nèi)復(fù)發(fā)的肝癌組織中同時(shí)高或低水平表達(dá)且2倍以上變化的lnc RNA,認(rèn)為其差異表達(dá)有意義。通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示這些差異表達(dá)的lnc RNA與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等相關(guān)基因有關(guān),部分還可能參與m TOR、NF-KB等信號(hào)通路調(diào)節(jié)。2、通過(guò)測(cè)序和組織篩選,我們發(fā)現(xiàn)lnc RNA SNHG16,其在早期復(fù)發(fā)的肝癌組織中均高表達(dá),經(jīng)q RT-PCR驗(yàn)證,lnc RNA SNHG16在肝癌細(xì)胞和早期復(fù)發(fā)肝癌組織中同時(shí)上調(diào)表達(dá)。SNHG16過(guò)表達(dá)與BCLC分期與腫瘤數(shù)目顯著相關(guān),Kaplan-Meier分析示SNHG16高表達(dá)與患者低生存率和高的腫瘤復(fù)發(fā)率有關(guān)。4、FISH定位分析發(fā)現(xiàn)SNHG16主要位于細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),少量在細(xì)胞核中表達(dá)。5、熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果表明SNHG16通過(guò)ce RNA機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mi R-17b-5p,調(diào)控P62的表達(dá)。6、q RT-PCR/Western-blot示SNHG16表達(dá)上調(diào)后,P62,P-m TOR顯著上調(diào),SNHG16表達(dá)下調(diào)后P62,P-m TOR下調(diào)。結(jié)論1、通過(guò)RNA-Seq,我們發(fā)現(xiàn)lnc RNA SNHG16,其在肝癌細(xì)胞及早期復(fù)發(fā)肝癌組織中均高表達(dá),SNHG16的表達(dá)與肝癌患者的病理特征相關(guān),且可預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后。2、SNHG16通過(guò)ce RNA競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制調(diào)控mi RNA-17b-5p調(diào)控靶基因P62的表達(dá),并激活下游m TOR通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,侵襲。因此,肝癌中可能存在SNHG16-P62-m TOR的調(diào)控機(jī)制,通過(guò)影響細(xì)胞增殖與凋亡促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展,這將為日后深入研究肝癌分子機(jī)制及臨床治療提供新思路。
【圖文】：

Fig 8. The luciferase report assay in Huh-7 cells.圖 8. Huh-7細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告。2.8. P62影響mTOR通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)2.8.1 生物信息學(xué)分析本研究前期通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SNHG16可能可以通過(guò)調(diào)節(jié)影響HCC中的mTOR通路，我們通過(guò)WB和PCR，，從蛋白和mRNA層Huh-7細(xì)胞中分析mTOR通路的激活情況。2.8.2 WB驗(yàn)證WB實(shí)驗(yàn)顯示：過(guò)表達(dá)的SNHG16相對(duì)NC有著更高的P62, mTOR, P
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 覃宏貴;PD-1、PD-L1在HCC組織中的表達(dá)和HCC組織中CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度及三者與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2623888