【摘要】：結(jié)腸癌是常見的消化道癌癥之一,全球第三大癌癥,全球死亡率第四。在我國結(jié)腸癌的發(fā)病率位居第四位,死亡率位居第五位,僅次于肺癌和胃癌。結(jié)腸癌5年生存率較低,治療和預(yù)后效果較差,已經(jīng)嚴(yán)重的影響了人類的健康。Wnt通路在生物的生長、發(fā)育和分化等多個方面發(fā)揮著重要的作用,己有的研究結(jié)果表明Wnt通路的異常表達(dá)與多種癌癥密切相關(guān),包括結(jié)腸癌。結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)�，F(xiàn)階段在結(jié)腸癌中己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 APC、β-catenin、KRAS、P53等基因突變,以及多種Wnt蛋白的異常表達(dá)。據(jù)報道Wnt6基因的多態(tài)性與結(jié)腸癌密切相關(guān),但Wnt6對結(jié)腸癌的作用還鮮有報道。本實驗擬通過研究比較正常人群結(jié)腸組織、結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織和癌旁組織中Wnt6mRNA和蛋白的表達(dá)量以及Wnt6對結(jié)腸癌細(xì)胞系的影響,來初步探討Wnt6對結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的作用,并為進(jìn)一步的研究Wnt6對結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。第一部分結(jié)腸癌組織Wnt6的表達(dá)量目的:檢測來源于正常人群的結(jié)腸組織、結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織和癌旁組織中Wnt6的表達(dá)量,初步判斷Wnt6與結(jié)腸癌之間的關(guān)系。方法:結(jié)腸癌組織來源于我院2015年7月至2016年7月原發(fā)性結(jié)腸癌術(shù)后病例45例,在手術(shù)時隨機(jī)收取對應(yīng)癌旁組織20例。收取20例經(jīng)胃腸鏡及其他影像學(xué)、實驗實檢查確診為正常人群的少量結(jié)腸組織。45例患者中男性23例,女性22例(年齡39～68歲,平均年齡54.44 ±7.03歲)。20例正常人群中男性11例,女性9例(年齡41～62歲,平均年齡52.15 ±5.91歲)。使用t檢驗和卡方檢驗對對照組和實驗組性別和年齡差異進(jìn)行分析。本實驗共分為3組:結(jié)腸癌組織組、癌旁組織組和正常結(jié)腸組織組。采用熒光定量PCR檢測各組所有樣品Wnt6的mRNA表達(dá)量。再從三組中各隨機(jī)抽取8個樣品,采用Western blotting檢測Wnt6的蛋白表達(dá)量。結(jié)果:患者和正常人群年齡(t=1.272,p=0.208)和性別(F=0.084,p=0.772)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)腸癌組織中Wnt6 mRNA的表達(dá)量顯著高于正常結(jié)腸組織和癌旁組織(P0.01)。癌旁組織中Wnt6的表達(dá)量與正常結(jié)腸組織之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從Western blotting的結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)隨機(jī)挑選的8個樣品,結(jié)腸癌組織中Wnt6蛋白的表達(dá)量高于癌旁組織和正常結(jié)腸組織。結(jié)論:高表達(dá)的Wnt6與結(jié)腸癌相關(guān),Wnt6可能在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。第二部分shRNA干擾和過表達(dá)Wnt6載體的構(gòu)建和結(jié)腸癌細(xì)胞系的選擇目的:構(gòu)建shRNA干擾Wnt6載體和過表達(dá)Wnt6載體,從5種結(jié)腸癌細(xì)胞系中篩選出高表達(dá)Wnt6的細(xì)胞系,用于shRNA干擾載體和過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染,獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,用于下一步的研究。方法:通過熒光定量PCR檢測5種結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo、SW480、HCT116、SW620和HT29中Wnt6的mRNA的表達(dá)水平,挑選出高表達(dá)Wnt6的細(xì)胞系。構(gòu)建shRNA干擾載體和過表達(dá)載體,用Lip02000進(jìn)行HCT116和SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時熒光顯微鏡下觀察各組(CON、shNC、shWnt6、EV和pWnt6)綠色熒光的表達(dá)情況,并采用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Wnt6的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:從熒光定量PCR結(jié)果,發(fā)現(xiàn)5種結(jié)腸癌細(xì)胞系中,SW620、HCT116和SW480這3種細(xì)胞系Wnt6的表達(dá)量最高,均顯著性高于LoVo細(xì)胞系(P＜0.01)。而LoVo和HT29細(xì)胞系中Wnt6表達(dá)量之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染shRNA干擾載體和過表達(dá)載體后24小時,在熒光顯微鏡下各組都可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染shRNA干擾載體后,HCT116和SW480細(xì)胞系Wnt6的mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P＜0.01),而轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體后HCT116和SW480細(xì)胞系Wnt6表達(dá)水平均顯著升高。結(jié)論:HCT116和SW480細(xì)胞系Wnt6表達(dá)量最高,shRNA干擾載體能夠有效的沉默Wnt6的表達(dá),過表達(dá)載體能夠有效地提高Wnt6的表達(dá)量。第三部分Wnt 6對HCT116和SW480兩種結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響目的:研究Wnt6對2種結(jié)腸癌細(xì)胞系生長的影響。方法:對HCT116和SW480細(xì)胞進(jìn)行shRNA干擾載體的轉(zhuǎn)染,shRNA干擾載體和過表達(dá)Wnt6載體的共轉(zhuǎn)染。用MTT法檢測各組(CON、shNC、shWnt6、EV和shWnt6+pWnt6)細(xì)胞中Wnt6對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。采用transwell檢測細(xì)胞的遷移能力以及采用Western blotting檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3以及遷移相關(guān)基因MMP2的蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:與shNC組相比,shWnt6組結(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力顯著降低(P0.01),細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加,細(xì)胞周期停滯在GO-G1期的比例顯著增加,細(xì)胞周期處于S期比例顯著減少,且細(xì)胞遷移能力降低,促細(xì)胞凋亡基因Bax蛋白表達(dá)水平上升,凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)水平下降,促進(jìn)細(xì)胞遷移基因MMP2的蛋白表達(dá)水平下降。而共轉(zhuǎn)染shWnt6干擾和過表達(dá)Wnt6載體后,與轉(zhuǎn)染shWnt6相比結(jié)果相反且存在顯著性差異。結(jié)論:Wnt6能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和遷移,該作用可能通過抑制細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)細(xì)胞的遷移實現(xiàn)。
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２．結(jié)腸癌組織中Ｗｎｔ６基因的蛋白表達(dá)量逡逑采用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ測定正常人群結(jié)腸組織、結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織和癌逡逑旁組織中Ｗｎｔ６蛋白的表達(dá)量，每組中的８個樣均為隨機(jī)抽取。結(jié)果如圖１．２。逡逑從圖可以，結(jié)腸癌組織中Ｗｎｔ６的蛋白表達(dá)量要高于正常結(jié)腸組織和癌旁組織。逡逑１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８逡逑正常結(jié)腸組織邐邐邐邐邋－逡逑癌旁組織邋邐邐邐邐邋．．…邐邐逡逑結(jié)腸癌組織邐邐逡逑｜３邋＾邋１１邋ｎ逡逑＾ＭＭＷＩｉｉｉｍＭＰ邋＾ＩＭＮＭＮＩＨＮＭＮＰ逡逑圖１．２正常組織和結(jié)腸癌組織Ｗｎｔ６蛋白表達(dá)量逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｗｎｔ６邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｏｎ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑１３逡逑

３．ｓｈＲＮＡ干擾和過表達(dá)對Ｗｎｔ６ｍＲＮＡ表達(dá)量的影響逡逑ＨＣＴ１１６和ＳＷ４８０細(xì)胞系轉(zhuǎn)染ＲＮＡ干擾和過表達(dá)Ｗｎｔ６載體，，２４ｈ后逡逑采用熒光定量ＰＣＲ檢測各組細(xì)胞Ｗｍ６ｍＲＮＡ的表達(dá)量，結(jié)果如圖２－３。逡逑ＨＣＴＩ１６和ＳＷ４８０細(xì)胞系中Ｗｎｔ６干擾組（ｓｈＷｎｔ６）和ｓｉＲＮＡ陰性對照組逡逑（ｓｈＮＣ）相比，Ｗｎｔ６ｍＲＮＡ表達(dá)量顯著性下降（尸＜０．０１〉，Ｗｎｔ６過表達(dá)組逡逑（ｐ＼Ｖｎｔ６）和過表達(dá)空載體組（ＥＶ）相比，Ｗｎｔ６ｍＲＮＡ表達(dá)量顯著性上升。逡逑２－５邐ＨＣＴ１１６邐】邐Ｓ

本文編號：2623740