【摘要】：結腸癌是常見的消化道癌癥之一,全球第三大癌癥,全球死亡率第四。在我國結腸癌的發(fā)病率位居第四位,死亡率位居第五位,僅次于肺癌和胃癌。結腸癌5年生存率較低,治療和預后效果較差,已經(jīng)嚴重的影響了人類的健康。Wnt通路在生物的生長、發(fā)育和分化等多個方面發(fā)揮著重要的作用,己有的研究結果表明Wnt通路的異常表達與多種癌癥密切相關,包括結腸癌。結腸癌的發(fā)生和發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關�，F(xiàn)階段在結腸癌中己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 APC、β-catenin、KRAS、P53等基因突變,以及多種Wnt蛋白的異常表達。據(jù)報道Wnt6基因的多態(tài)性與結腸癌密切相關,但Wnt6對結腸癌的作用還鮮有報道。本實驗擬通過研究比較正常人群結腸組織、結腸癌患者結腸癌組織和癌旁組織中Wnt6mRNA和蛋白的表達量以及Wnt6對結腸癌細胞系的影響,來初步探討Wnt6對結腸癌發(fā)生和發(fā)展的作用,并為進一步的研究Wnt6對結腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制奠定基礎。第一部分結腸癌組織Wnt6的表達量目的:檢測來源于正常人群的結腸組織、結腸癌患者結腸癌組織和癌旁組織中Wnt6的表達量,初步判斷Wnt6與結腸癌之間的關系。方法:結腸癌組織來源于我院2015年7月至2016年7月原發(fā)性結腸癌術后病例45例,在手術時隨機收取對應癌旁組織20例。收取20例經(jīng)胃腸鏡及其他影像學、實驗實檢查確診為正常人群的少量結腸組織。45例患者中男性23例,女性22例(年齡39～68歲,平均年齡54.44 ±7.03歲)。20例正常人群中男性11例,女性9例(年齡41～62歲,平均年齡52.15 ±5.91歲)。使用t檢驗和卡方檢驗對對照組和實驗組性別和年齡差異進行分析。本實驗共分為3組:結腸癌組織組、癌旁組織組和正常結腸組織組。采用熒光定量PCR檢測各組所有樣品Wnt6的mRNA表達量。再從三組中各隨機抽取8個樣品,采用Western blotting檢測Wnt6的蛋白表達量。結果:患者和正常人群年齡(t=1.272,p=0.208)和性別(F=0.084,p=0.772)之間的差異無統(tǒng)計學意義。結腸癌組織中Wnt6 mRNA的表達量顯著高于正常結腸組織和癌旁組織(P0.01)。癌旁組織中Wnt6的表達量與正常結腸組織之間的差異無統(tǒng)計學意義。從Western blotting的結果,可以發(fā)現(xiàn)隨機挑選的8個樣品,結腸癌組織中Wnt6蛋白的表達量高于癌旁組織和正常結腸組織。結論:高表達的Wnt6與結腸癌相關,Wnt6可能在結腸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。第二部分shRNA干擾和過表達Wnt6載體的構建和結腸癌細胞系的選擇目的:構建shRNA干擾Wnt6載體和過表達Wnt6載體,從5種結腸癌細胞系中篩選出高表達Wnt6的細胞系,用于shRNA干擾載體和過表達載體的轉(zhuǎn)染,獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,用于下一步的研究。方法:通過熒光定量PCR檢測5種結腸癌細胞系LoVo、SW480、HCT116、SW620和HT29中Wnt6的mRNA的表達水平,挑選出高表達Wnt6的細胞系。構建shRNA干擾載體和過表達載體,用Lip02000進行HCT116和SW480細胞的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時熒光顯微鏡下觀察各組(CON、shNC、shWnt6、EV和pWnt6)綠色熒光的表達情況,并采用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞Wnt6的mRNA表達水平。結果:從熒光定量PCR結果,發(fā)現(xiàn)5種結腸癌細胞系中,SW620、HCT116和SW480這3種細胞系Wnt6的表達量最高,均顯著性高于LoVo細胞系(P＜0.01)。而LoVo和HT29細胞系中Wnt6表達量之間的差異無統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)染shRNA干擾載體和過表達載體后24小時,在熒光顯微鏡下各組都可以觀察到綠色熒光蛋白的表達。轉(zhuǎn)染shRNA干擾載體后,HCT116和SW480細胞系Wnt6的mRNA表達水平均顯著下降(P＜0.01),而轉(zhuǎn)染過表達載體后HCT116和SW480細胞系Wnt6表達水平均顯著升高。結論:HCT116和SW480細胞系Wnt6表達量最高,shRNA干擾載體能夠有效的沉默Wnt6的表達,過表達載體能夠有效地提高Wnt6的表達量。第三部分Wnt 6對HCT116和SW480兩種結腸癌細胞生長的影響目的:研究Wnt6對2種結腸癌細胞系生長的影響。方法:對HCT116和SW480細胞進行shRNA干擾載體的轉(zhuǎn)染,shRNA干擾載體和過表達Wnt6載體的共轉(zhuǎn)染。用MTT法檢測各組(CON、shNC、shWnt6、EV和shWnt6+pWnt6)細胞中Wnt6對結腸癌細胞增殖能力的影響。采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡和細胞周期。采用transwell檢測細胞的遷移能力以及采用Western blotting檢測凋亡相關基因Bax、Caspase-3以及遷移相關基因MMP2的蛋白表達水平的變化。結果:與shNC組相比,shWnt6組結腸癌細胞增殖能力顯著降低(P0.01),細胞凋亡數(shù)目顯著增加,細胞周期停滯在GO-G1期的比例顯著增加,細胞周期處于S期比例顯著減少,且細胞遷移能力降低,促細胞凋亡基因Bax蛋白表達水平上升,凋亡相關蛋白Caspase-3表達水平下降,促進細胞遷移基因MMP2的蛋白表達水平下降。而共轉(zhuǎn)染shWnt6干擾和過表達Wnt6載體后,與轉(zhuǎn)染shWnt6相比結果相反且存在顯著性差異。結論:Wnt6能夠促進癌細胞的生長和遷移,該作用可能通過抑制細胞的凋亡、促進細胞的遷移實現(xiàn)。
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２．結腸癌組織中Ｗｎｔ６基因的蛋白表達量逡逑采用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ測定正常人群結腸組織、結腸癌患者結腸癌組織和癌逡逑旁組織中Ｗｎｔ６蛋白的表達量，每組中的８個樣均為隨機抽取。結果如圖１．２。逡逑從圖可以，結腸癌組織中Ｗｎｔ６的蛋白表達量要高于正常結腸組織和癌旁組織。逡逑１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８逡逑正常結腸組織邐邐邐邐邋－逡逑癌旁組織邋邐邐邐邐邋．．…邐邐逡逑結腸癌組織邐邐逡逑｜３邋＾邋１１邋ｎ逡逑＾ＭＭＷＩｉｉｉｍＭＰ邋＾ＩＭＮＭＮＩＨＮＭＮＰ逡逑圖１．２正常組織和結腸癌組織Ｗｎｔ６蛋白表達量逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｗｎｔ６邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｏｎ邋ｃａｎｃｅｒ逡逑１３逡逑

３．ｓｈＲＮＡ干擾和過表達對Ｗｎｔ６ｍＲＮＡ表達量的影響逡逑ＨＣＴ１１６和ＳＷ４８０細胞系轉(zhuǎn)染ＲＮＡ干擾和過表達Ｗｎｔ６載體，，２４ｈ后逡逑采用熒光定量ＰＣＲ檢測各組細胞Ｗｍ６ｍＲＮＡ的表達量，結果如圖２－３。逡逑ＨＣＴＩ１６和ＳＷ４８０細胞系中Ｗｎｔ６干擾組（ｓｈＷｎｔ６）和ｓｉＲＮＡ陰性對照組逡逑（ｓｈＮＣ）相比，Ｗｎｔ６ｍＲＮＡ表達量顯著性下降（尸＜０．０１〉，Ｗｎｔ６過表達組逡逑（ｐ＼Ｖｎｔ６）和過表達空載體組（ＥＶ）相比，Ｗｎｔ６ｍＲＮＡ表達量顯著性上升。逡逑２－５邐ＨＣＴ１１６邐】邐Ｓ

本文編號：2623740