發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 07:57

【摘要】：第一部分PDAC組織中BC043614的表達(dá)及臨床意義研究研究背景胰導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是死亡率極高的惡性腫瘤之一,全球范圍內(nèi),其死亡率分別居男性癌癥第八位和女性癌癥的第九位。雖然近年來(lái)在早期發(fā)現(xiàn)和癌癥治療方面取得的進(jìn)展使得PDAC死亡率有一定程度下降,但作為一種異質(zhì)性極其復(fù)雜的疾病,PDAC仍然是一個(gè)重要的的公共衛(wèi)生問(wèn)題。由PDAC引起的高死亡率歸因于在疾病轉(zhuǎn)移到其他器官之前未能及時(shí)診斷疾病,以及癌細(xì)胞對(duì)目前治療方法的耐受。PDAC進(jìn)展是由多種遺傳和表觀遺傳改變引起的,這些改變激活了細(xì)胞的各種畸變和出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的各種特征。畸變的積累促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化并賦予其腫瘤表型。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lnc RNAs)這一類(lèi)新的基因表達(dá)的調(diào)控分子作為遺傳和表觀遺傳失調(diào)的原因之一,最近得到了廣泛的關(guān)注。本課題應(yīng)用GEO大數(shù)據(jù)結(jié)合臨床樣本進(jìn)行分析,篩選在PDAC中顯著差異表達(dá)的lnc RNA,判斷其臨床表達(dá)意義。研究方法本研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)(GSE16515和GSE32688)進(jìn)行分析,挑選其中顯著差異表達(dá)的lnc RNA-BC043614在我們收集的胰腺癌組織中進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá);采用卡方檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性分析對(duì)BC043614表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;采用Kaplan-Meier生存函數(shù)(Log rank檢驗(yàn))及Cox回歸分析研究BC043614表達(dá)對(duì)PDAC患者的總生存時(shí)間(Overall survival,OS)的預(yù)測(cè)價(jià)值。研究結(jié)果GEO數(shù)據(jù)分析顯示有24個(gè)lnc RNA在PDAC中差異表達(dá),其中l(wèi)nc RNA-BC043614在PDAC組織中高表達(dá)最為顯著;隨后RT-q PCR結(jié)果證實(shí),其在42對(duì)PDAC組織中表達(dá)顯著高于正常胰腺組織(P0.01);在進(jìn)展期,腫瘤大小2cm,和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PDAC組織中表達(dá)顯著高于早期(P=0.0119),腫瘤大小≤2cm(P=0.0176)和未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0099)的PDAC組織;卡方分析結(jié)果表明BC043614的表達(dá)與CA19-9、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、有無(wú)脈管癌栓相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與性別、年齡、腫瘤的部位無(wú)關(guān);Kaplan-Meier生存曲線顯示BC043614高表達(dá)組的患者其OS顯著低于低表達(dá)組(P0.01);單因素和多因素COX回歸分析顯示lnc RNA-BC043614表達(dá)(P=0.010)是影響PDAC預(yù)后的獨(dú)立因素。研究結(jié)論通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)胰腺癌lnc RNA表達(dá)數(shù)據(jù)分析,篩選出在PDAC中顯著差異表達(dá)lnc RNA-BC043614,進(jìn)一步臨床樣本驗(yàn)證結(jié)果表明BC043614在PDAC中高表達(dá)且與多項(xiàng)臨床病理參數(shù)及預(yù)后顯著相關(guān)。BC043614可作為臨床病理監(jiān)測(cè)PDAC進(jìn)展并預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的一個(gè)重要的參考指標(biāo)。第二部分BC043614在PDAC中的功能研究研究背景l(fā)nc RNA與許多生物過(guò)程有關(guān),例如選擇性剪接、蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)定位的交替以及表觀遺傳調(diào)節(jié)(DNA甲基化,染色質(zhì)重構(gòu),組蛋白修飾和基因沉默),是一類(lèi)在腫瘤中廣泛發(fā)揮作用的調(diào)控分子。既往研究表明lnc RNA-BC043614可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的惡性表型,但其在PDAC中的上調(diào)是PDAC惡性發(fā)展的促進(jìn)因素還是只是一種單純的伴隨現(xiàn)象,其是否可以促進(jìn)PDAC惡性表型?其具體功能如何?尚不清楚。闡明BC043614在PDAC中的生物學(xué)功能有助于明確其對(duì)PDAC的影響及未來(lái)的臨床靶向治療價(jià)值。研究方法利用載體構(gòu)建、基因克隆?RNA干擾?瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等手段,在PDAC細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)或敲減BC043614表達(dá)水平;應(yīng)用CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)觀察BC043614對(duì)PDAC細(xì)胞增殖能力的影響;采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)BC043614對(duì)PDAC細(xì)胞凋亡的影響;采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察BC043614對(duì)PDAC細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。研究結(jié)果檢測(cè)6種PDAC細(xì)胞株及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中BC043614的相對(duì)表達(dá)水平,證實(shí)BC043614在PDAC細(xì)胞株中相對(duì)表達(dá)水平顯著高于正常人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株(P0.05),通過(guò)在PDAC細(xì)胞株中進(jìn)行的CCK-8實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)BC043614可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力(P0.05),敲減BC043614后腫瘤細(xì)胞增殖則明顯受阻(P0.05);流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)BC043614可顯著降低腫瘤細(xì)胞的凋亡率(P0.05),而敲減BC043614后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡(P0.05)。transwell實(shí)驗(yàn)提示過(guò)表達(dá)BC043614可顯著促進(jìn)PDAC細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P0.05),敲減BC043614后腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力則明顯被抑制(P0.05)。研究結(jié)論體外實(shí)驗(yàn)表明BC043614可促進(jìn)PDAC細(xì)胞的增殖?遷移和轉(zhuǎn)移能力,抑制PDAC細(xì)胞凋亡,促進(jìn)PDAC惡性進(jìn)程。BC043614在PDAC中的上調(diào)是PDAC癌惡性行為的促進(jìn)因素而非伴隨現(xiàn)象,BC043614在PDAC中發(fā)揮功能的具體下游分子機(jī)制有待闡明。第三部分BC043614下游靶分子的篩選與鑒定研究背景一個(gè)lnc RNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可具有多種作用模式,BC043614分子通過(guò)多途徑多機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,已知BC043614可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin、Rho A/Rac2和PTEN/p-AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用,也可通過(guò)，

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