【摘要】：研究背景:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率高、起病隱匿、復(fù)發(fā)率高、較常耐藥,目前治療上仍采取手術(shù)治療為主,但預(yù)后仍差強(qiáng)人意,因此尋找新的具有診斷及預(yù)后價(jià)值的分子靶標(biāo)是十分必要的。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA中的一種類型,以RNA形式在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后修飾等方面調(diào)控基因的表達(dá)。既往研究顯示miR-196b-5p在多種惡性腫瘤里異常表達(dá)并影響著腫瘤細(xì)胞的各種生物學(xué)行為,然而miR-196b-5p在肝細(xì)胞癌中的臨床意義及發(fā)揮作用的具體機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。內(nèi)皮素受體B(endothelin receptor type B,EDNRB)是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一。研究表明,EDNRB在多種惡性腫瘤異常表達(dá),同時(shí)參與了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。已有研究提出EDNRB肝細(xì)胞癌里低表達(dá),同時(shí)可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而,miR-196b-5p與EDNRB的關(guān)系未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,兩者在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的分子機(jī)制也仍待進(jìn)一步闡明。研究目的:探索miR-196b-5p與EDNRB在肝細(xì)胞癌患者中的臨床意義及可能機(jī)制。研究方法:1.通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)里的miRNA的表達(dá)及臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析,同時(shí)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)里的miRNA芯片進(jìn)行分析,探索miR-196b-5p在肝細(xì)胞癌里的表達(dá)水平及臨床意義。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)67例肝細(xì)胞癌患者癌和相對(duì)應(yīng)癌旁石蠟包埋組織miR-196b-5p的相對(duì)表達(dá)量,比較其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。3.聯(lián)合TCGA、GEO及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的miR-196b-5p表達(dá)量結(jié)果行Meta分析。4.通過(guò)12個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)miR-196b-5p的靶基因,挑選出至少在5個(gè)軟件均能預(yù)測(cè)得到的基因與TCGA表達(dá)下調(diào)的mRNA取交集,篩選出miR-196b-5p的潛力靶基因。對(duì)潛力靶基因進(jìn)行GO和DO功能注釋、KEGG通路富集分析、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、Spearman秩相關(guān)分析及結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè),而后結(jié)合文獻(xiàn)選定miR-196b-5p的靶基因進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。5.通過(guò)TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析EDNRB的表達(dá)譜數(shù)據(jù),探索EDNRB在肝細(xì)胞癌里的表達(dá)水平及臨床意義。6.通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)上述67例肝細(xì)胞癌患者癌和相對(duì)應(yīng)癌旁石蠟包埋組織EDNRB的蛋白表達(dá)量,比較其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。7.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miR-196b-5p與EDNRB是否有直接結(jié)合的靶向關(guān)系。研究結(jié)果:1.對(duì)TCGA測(cè)序數(shù)據(jù)與GEO芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織里顯著高于正常對(duì)照肝組織(SMD=0.54,95%CI:0.35-0.73,P _(heterogeneity)=0.206,I~2=26.7%),同時(shí)其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者性別(P=0.035)、病理分級(jí)(P=0.041)、脈管浸潤(rùn)(P=0.023)有密切關(guān)系。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了miR-196b-5p的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織里顯著高于相對(duì)應(yīng)的癌旁肝組織(P=0.0007)。miR-196b-5p表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者的腫瘤大小(P=0.03)、結(jié)節(jié)數(shù)量(P=0.024)、脈管浸潤(rùn)(P=0.029)及包膜浸潤(rùn)(P=0.026)相關(guān)。3.聯(lián)合TCGA、GEO及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的miR-196b-5p表達(dá)量結(jié)果行Meta分析,結(jié)果證實(shí)miR-196b-5p的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織里顯著高于正常對(duì)照肝組織(SMD=0.56,95%CI:0.39-0.72,P _(heterogeneity)=0.275,I~2=18.3%)。4.通過(guò)12個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)miR-196b-5p的靶基因,挑選出至少在5個(gè)軟件均能預(yù)測(cè)得到的基因與TCGA表達(dá)下調(diào)的mRNA取交集,最終得到107個(gè)miR-196b-5p的潛力靶基因。對(duì)107個(gè)潛力靶基因進(jìn)行GO和DO功能注釋、KEGG通路富集分析以及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,重點(diǎn)研究KEGG癌癥通路里的9個(gè)基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)數(shù)據(jù)對(duì)KEGG通路里的9個(gè)基因行Spearman秩相關(guān)分析,結(jié)果顯示miR-196b-5p與EDNRB、雄激素受體(androgen receptor,AR)、叉頭框O1基因(forkhead box O1,FOXO1)及胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系,同時(shí)軟件預(yù)測(cè)到miR-196b-5p與EDNRB、FOXO1存在堿基互補(bǔ)配對(duì)的情況,結(jié)合文獻(xiàn)篩選定EDNRB進(jìn)行下一步研究。5.分析TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中EDNRB的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)EDNRB的表達(dá)水平在肝細(xì)胞癌組織里低于正常對(duì)照肝組織(SMD=-1.48,95%CI:-1.63-(-1.33),P _(heterogeneity)=0.116,I~2=32.4%)。6.免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)EDNRB蛋白在肝細(xì)胞癌組織里的表達(dá)低于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P0.0001)。分析EDNRB表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,結(jié)果顯示EDNRB的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者血檢AFP的量(P=0.055)有相關(guān)的趨勢(shì),需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)。7.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-196b-5p與EDNRB未存在直接結(jié)合的靶向關(guān)系。研究結(jié)論:1.miR-196b-5p在肝細(xì)胞癌組織里的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照肝組織,其表達(dá)量與脈管浸潤(rùn)等肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床病理參數(shù)有密切關(guān)系。2.EDNRB在肝細(xì)胞癌組織里的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照肝組織。3.miR-196b-5p與EDNRB對(duì)肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移可能發(fā)揮了重要作用,但兩者沒(méi)有直接結(jié)合的靶向關(guān)系,其發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
【圖文】：

等提出其在肝細(xì)胞癌里呈高表達(dá)，但對(duì)于 miR-196b-5p 在肝細(xì)胞癌中具體的臨床意義及作用機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在通過(guò) TCGA（The CancerGenomeAtlas）（https://cancergenome.nih.gov/）RNA 測(cè)序（RNA-sequencing，RNA-seq ） 數(shù) 據(jù) 和 GEO （ Gene Expression Omnibus ）（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ） 微 陣 列 （ microarray ） 數(shù) 據(jù) 分 析miR-196b-5p 在肝細(xì)胞癌的臨床意義，隨后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction, qRT-PCR）驗(yàn)證。同時(shí)，通過(guò)軟件預(yù)測(cè) miR-196b-5p 的靶基因，再通過(guò)計(jì)算生物學(xué)及免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）證實(shí)靶基因的表達(dá)及臨床意義，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System）檢測(cè)miR-196b-5p 與靶基因是否有直接結(jié)合的靶向關(guān)系，從而探討 miR-196b-5p在肝細(xì)胞癌里發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制。

miR-196b-5p 與 EDNRB 在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的初步探究 碩士學(xué)位論文癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制也仍待進(jìn)一步闡明。本研究通過(guò)計(jì)算生物學(xué)及免疫組織化學(xué)證實(shí)肝細(xì)胞癌組織及正常對(duì)照組織中 EDNRB mRNA 和蛋白的表達(dá)情況，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè) miR-196b-5p 與 EDNRB 是否有直接結(jié)合的靶向關(guān)系，初步探索 miR-196b-5p 與 EDNRB 對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的影響，流程圖如圖 3 所示。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2621705