發(fā)布時間：2020-04-09 13:16

【摘要】：肺癌是全球癌癥死亡的主要原因,其中大多數(shù)是非小細胞肺癌。順鉑是一種被廣泛用作治療肺癌的一線化療藥,其通過抑制細胞增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移起作用。然而,由于順鉑在治療腫瘤的過程中常常會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,這降低了其療效并限制了其臨床應用,因此急需進一步探索更為有效的治療藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)肺癌的發(fā)生與線粒體融合和分裂的失調(diào)相關(guān)。發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)是線粒體分裂所必需的。抑制肺癌細胞中Drp1可以降低肺癌細胞的增殖,增加細胞的凋亡。Dynasore是一種小分子的非選擇性GTPase活性抑制劑,無論在體內(nèi)還是體外,均可以抑制dynamin 1,dynamin 2和Drp1的GTPase活性。然而,Dynasore對肺癌A549細胞凋亡,增殖,侵襲及轉(zhuǎn)移的影響尚不明確。目的:本課題主要探究Dynasore對肺癌A549細胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機制,并同時檢測順鉑及其聯(lián)合Dynasore用藥對肺癌A549的抗癌作用,旨在探索出更為有效的肺癌治療策略。研究方法:首先利用蛋白印記技術(shù)檢測肺癌細胞系A(chǔ)549、H1299、H460和LK2以及人支氣管上皮樣細胞HBE細胞中Drp1蛋白表達水平。根據(jù)結(jié)果篩選出重點檢測細胞系為肺癌A549,然后將A549細胞隨機分為四組,分別為:對照組(Control,3%DMSO),順鉑組(Cisplatin,30μM),Dynasore組(Dynasore,80μM)和Dynasore+順鉑組(Dynasore 80μM,Cisplatin 30μM)。各組細胞干預處理后,采用MTT法檢測各組細胞活性;采用克隆形成實驗檢測各組增殖能力;采用熒光分光光度計參照JC-1試劑盒和活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒操作說明檢測各組線粒體膜電位(mitochondrial membrane potentials,MMP)和ROS含量;采用721分光光度計參照三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)試劑盒操作說明檢測ATP、MDA和GSH含量;采用基質(zhì)膠侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力;采用劃痕試驗檢測各組細胞轉(zhuǎn)移能力;采用蛋白印記技術(shù)檢測線粒體分裂蛋白Drp1、發(fā)動蛋白2(Dynamin 2)、增殖細胞核抗原(ProliferatingCell NuclearAntigen,PCNA)、細胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)、細胞凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平;采用免疫熒光標記技術(shù)檢測線粒體分裂蛋白Drp1、Dynamin 2、PCNA和Cleaved Caspase-3表達水平。結(jié)果:1、與HBE細胞系比較,A549、H1299、H460和LK2細胞中的Drp1蛋白含量均明顯升高(P0.05),A549細胞系中Drp1表達含量明顯高于其它幾種細胞系(P0.05),但是H1299、H460和LK2這三種細胞系中Drp1表達無明顯差異。2、Dynasore抑制肺癌A549細胞中Drp1和dynamin 2的表達。蛋白印記實驗結(jié)果如下:與Control組比較,Dynasore組中Drp1和Dynamin 2含量明顯降低,順鉑組和Dynasore+順鉑組的Drp1和Dynamin 2含量明顯升高(P0.05);與順鉑組比較,Dynasore組和Dynasore+順鉑組Drp1和Dynamin 2含量均明顯降低(P0.05);與Dynasore組比較,Dynasore+順鉑組的Drp1和Dynamin 2含量明顯升高(P0.05)。免疫熒光實驗中,我們采用Drp1和Dynamin 2平均熒光強度來反映各組中Drp1和Dynamin 2蛋白表達水平。免疫熒光結(jié)果與上述蛋白印記結(jié)果相一致(P0.05)。3、Dynasore抑制肺癌A549細胞增殖水平。蛋白印記結(jié)果如下:與Control組比較,Dynasore組,順鉑組和Dynasore+順鉑組的PCNA表達水平明顯降低(P0.05);與順鉑組比較,Dynasore組PCNA表達水平明顯升高,而Dynasore+順鉑組的PCNA表達水平明顯降低(P0.05);與Dynasore組比較,Dynasore+順鉑組的PCNA表達水平明顯降低(P0.05)。免疫熒光實驗中,我們采用PCNA蛋白平均熒光強度來反映各組中PCNA蛋白表達水平。研究發(fā)現(xiàn)免疫熒光結(jié)果與上述蛋白印記結(jié)果相一致(P0.05)。MTT實驗和克隆形成實驗結(jié)果:與Control組比較,Dynasore組,順鉑組和Dynasore+順鉑組的細胞活性和增殖能力均明顯降低(P0.05);與順鉑組比較,Dynasore組細胞活性和增殖能力明顯升高,而Dynasore+順鉑組的細胞活性和增殖能力明顯降低(P0.05);與Dynasore組比較,Dynasore+順鉑組的細胞活性和增殖能力明顯降低(P0.05)。這些結(jié)果與PCNA的蛋白檢測結(jié)果相一致。4、Dynasore誘導肺癌A549細胞線粒體功能障礙。與Control組比較,Dynasore組,順鉑組和Dynasore+順鉑組的MMP、ATP和GSH明顯降低,而ROS和MDA含量明顯升高(P0.05);與順鉑組比較,Dynasore組MMP、ATP和GSH明顯升高,ROS和MDA含量明顯降低,而Dynasore+順鉑組的MMP、ATP和GSH明顯降低,ROS和MDA含量明顯升高(P0.05);與Dynasore組比較,Dynasore+順鉑組的MMP、ATP和GSH明顯降低,ROS和MDA含量明顯升高(P0.05)。5、Dynasore激活肺癌A549細胞線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡。蛋白印記結(jié)果如下:與Control組比較,Dynasore組,順鉑組和Dynasore+順鉑組的線粒體內(nèi)Cyt C和AIF含量明顯降低,胞漿內(nèi)Cyt C和細胞核內(nèi)AIF含量以及Cleaved Caspase-3表達水平明顯升高(P0.05);與順鉑組比較,Dynasore組線粒體內(nèi)Cyt C和AIF含量明顯升高,胞漿內(nèi)Cyt C和細胞核內(nèi)AIF含量以及Cleaved Caspase-3表達水平明顯降低,而Dynasore+順鉑組的線粒體內(nèi)Cyt C和AIF含量明顯降低,胞漿內(nèi)Cyt C和細胞核內(nèi)AIF的含量以及Cleaved Caspase-3表達水平明顯升高(P0.05);與Dynasore組比較,Dynasore+順鉑組的線粒體內(nèi)Cyt C和AIF含量明顯降低,胞漿內(nèi)Cyt C和細胞核內(nèi)AIF含量以及Cleaved Caspase-3表達水平明顯升高(P0.05)。我們進一步采用免疫熒光技術(shù),采用Cleaved Caspase-3陽性細胞數(shù)反映各組中Cleaved Caspase-3表達水平,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組中Cleaved Caspase-3陽性細胞數(shù)變化趨勢與上述蛋白印記檢測結(jié)果一致。6、Dynasore抑制肺癌A549細胞的侵襲和遷移。與Control組比較,Dynasore組,順鉑組和Dynasore+順鉑組的侵襲細胞數(shù)均明顯減少,細胞轉(zhuǎn)移能力均明顯降低(P0.05);與順鉑組比較,Dynasore組侵襲細胞數(shù)明顯增多,細胞轉(zhuǎn)移能力明顯增高,而Dynasore+順鉑組的侵襲細胞數(shù)明顯減少,細胞轉(zhuǎn)移能力明顯降低(P0.05);與Dynasore組比較,Dynasore+順鉑組的侵襲細胞數(shù)明顯減少,細胞轉(zhuǎn)移能力明顯降低(P0.05)。結(jié)論:Dynasore抑制肺癌A549細胞增殖,侵襲和轉(zhuǎn)移,并且誘導細胞凋亡,其機制可能與抑制線粒體分裂和細胞自噬有關(guān);Dynasore可以增強順鉑對肺癌A549細胞的抗癌作用。
【圖文】：

19圖 3.2 Dynasore 抑制 A549 細胞中 Drp1 和 dynamin 2 的表達（n = 6）A：各組 A549 細胞中 Drp1 和 dynamin 2 經(jīng)典蛋白印記條帶。B-C：定量分析 Drp1 (B)和 dynamin2 (C)蛋白表達水平。β-actin 是胞漿蛋白的內(nèi)參蛋白。D-F：各組 A549 細胞中 Drp1(D，綠色) 和dynamin 2 (F，紅色)經(jīng)典免疫熒光圖片。細胞核用 DAPI 標記（藍色）。比例尺=200 μm (Drp1)和 50 μm (dynamin 2). E-G：定量分析 Drp1 (E) 和 dynamin 2 (G)的平均熒光強度值。與 control

圖3.3 Dynasore 體外抑制 A549細胞增殖能力（n = 6）A：各組 A549 細胞中 PCNA 經(jīng)典蛋白印記條帶。B：定量分析 PCNA 蛋白表達水平。β-actin是胞漿蛋白的內(nèi)參蛋白。C：各組 A549 細胞中 PCNA(綠色)經(jīng)典免疫熒光圖片。細胞核用 DAPI標記（藍色），比例尺=50 μm. D：定量分析 PCNA 的平均熒光強度值。E：各組 A549 細胞增殖能力。F-G：各組 A549 細胞集落形成經(jīng)典圖片（F）及定量分析結(jié)果（G）。與 control 組比較，aP < 0.05；與 cisplatin 組比較，bP < 0.05；與 Dynasore 組比較，cP < 0.05。3.4 Dynasore 誘導 A549 細胞線粒體功能障礙正常 MMP 的維持是線粒體氧化磷酸化和 ATP 產(chǎn)生所必需的[26]。線粒體 ROS在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用[4]。MDA 和 GSH 被認為是細胞內(nèi)氧化水平的經(jīng)典指標[27]。與 Control 組比較，Dynasore 組，順鉑組和 Dynasore+順鉑組的 MMP、ATP 和 GSH明顯降低，，而 ROS 和 MDA 含量明顯升高（P<0.05）；與順鉑組比較，Dynasore 組MMP、ATP 和 GSH 明顯升高，ROS 和 MDA 含量明顯降低，而 Dynasore+順鉑組
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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本文編號：2620802