【摘要】：核酸適配體作為新興的識別分子,具有高親和力、高特異性、易合成修飾、設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于腫瘤診斷和治療等領(lǐng)域。然而,核酸適配體往往存在序列較長、構(gòu)型設(shè)計(jì)復(fù)雜、標(biāo)記成本較高等缺點(diǎn),因此,對其進(jìn)行序列改造是非常有必要的。其中,通過對核酸適配體進(jìn)行裂分獲得的裂開型核酸適配體,巧妙地彌補(bǔ)了以上的缺點(diǎn)。此外,基于核酸適配體的light-up熒光探針為發(fā)展高信背比、高特異性和免標(biāo)記的檢測方法提供了新的契機(jī)。基于此,本論文以發(fā)展免標(biāo)記、低成本和高靈敏的腫瘤細(xì)胞檢測方法為目標(biāo),通過對核酸適配體序列進(jìn)行裁剪、裂分和拼接,設(shè)計(jì)了一種雙功能裂開型核酸適配體探針,以腫瘤細(xì)胞為研究對象,建立了兩種檢測方法。具體研究內(nèi)容如下:一、雙功能裂開型核酸適配體的構(gòu)建及其腫瘤細(xì)胞免標(biāo)記檢測研究利用人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的特異性核酸適配體與激活硫黃素T(ThT)熒光的核酸適配體,通過裁剪、裂分和拼接等過程,設(shè)計(jì)了一種新的雙功能裂開型核酸適配體探針(BFSA)。BFSA與ThT混合后形成BFSA/ThT復(fù)合探針,此時ThT的熒光被激活。該復(fù)合探針能夠特異性結(jié)合靶細(xì)胞,通過洗滌去除多余探針,即可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞SMMC-7721的免標(biāo)記和低成本檢測。該探針在100μL結(jié)合緩沖液中最低檢測到了125個細(xì)胞,且實(shí)現(xiàn)了對20%人血清樣品中靶細(xì)胞的定量檢測,此方法為腫瘤和醫(yī)學(xué)診斷研究提供了一種新的思路。二、靶標(biāo)介導(dǎo)組裝的light-up熒光探針用于腫瘤細(xì)胞的一步式檢測研究在上一個研究工作中,我們設(shè)計(jì)的BFSA雖然能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免標(biāo)記檢測,但需要洗去未結(jié)合的探針來降低背景信號,使得操作較為復(fù)雜。如果將BFSA的一個片段與一條互補(bǔ)序列雜交,先封閉熒光染料的激活區(qū)域,設(shè)計(jì)成一種激活式的熒光探針,有望解決以上問題。鑒于此,我們建立了一種靶標(biāo)介導(dǎo)組裝的light-up熒光探針:在無靶標(biāo)時,BFSA的兩個片段相互獨(dú)立,并且其與ThT結(jié)合的區(qū)域被封閉,因此熒光信號微弱;而當(dāng)靶標(biāo)存在時,則會誘導(dǎo)各片段的組裝,BFSA激活ThT熒光的功能恢復(fù),從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號,實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞SMMC-7721的免洗的一步式檢測。該探針在100μL結(jié)合緩沖液中可檢測到125個細(xì)胞,且在20%人血清樣品中具有良好的穩(wěn)定性。此外,該探針具有良好的選擇性,可明顯區(qū)分靶細(xì)胞與對照細(xì)胞。本方法只需將核酸適配體、熒光報告分子與靶標(biāo)混合便能產(chǎn)生可檢測的熒光信號,實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的免洗、免標(biāo)記、低成本的一步式檢測。三、自動化工作站輔助的人血管生長素核酸適配體的篩選研究在以上研究工作中,我們發(fā)現(xiàn)并非所有的核酸適配體都適合設(shè)計(jì)成裂開型探針,因此,篩選更多的核酸適配體對解決這一問題顯然是有幫助的。然而,經(jīng)典的篩選方法過程繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力,非常有必要利用儀器設(shè)備來提高操作的自動化程度。有鑒于此,我們將自動化工作站引入到SELEX技術(shù)的操作流程中,以血管生長素(ANG)為靶標(biāo)進(jìn)行核酸適配體的篩選。目前已將恒溫孵育、磁分離、單鏈制備與純化等操作集成在自動化工作站上完成。經(jīng)過了12輪的篩選工作,一共選擇了16條序列做進(jìn)一步的表征。結(jié)果表明,Y8和Y18能夠特異性結(jié)合ANG,解離常數(shù)分別為108.4 nM和177.1 nM。隨后又對Y8和Y18進(jìn)行了序列優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)將前后引物去掉后的Y8-1和Y18-1對ANG的結(jié)合能力并沒有因此被削弱。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)截短后Y8-1和Y18-1還具有增強(qiáng)Hemin催化過氧化氫分解的能力,甚至比已知的G-四聚體序列Dz-11更強(qiáng)。因此,我們篩選得到的兩條核酸適配體不僅能夠用于識別ANG,還有望被用來發(fā)展基于脫氧核酶活性的檢測方法。
【圖文】：

建成一種二價核酸適配體。如圖 1.7A 所示，38-GC 是由三個雙鏈莖部（stem1,2和 3）和兩個環(huán)部（GAA 和 AAA）組成的三向連接結(jié)構(gòu)，中心為靶標(biāo)的結(jié)合區(qū)域，作者將 38-GC 裂成兩對不同的片段，其中莖部 3 保持原結(jié)構(gòu)，隨后將兩組裂開的片段連接在一起，形成一種新的裂開型二價核酸適配體 CBSA（短片段是 SF，長片段是 LF）。此外，Tan 等[59]利用 T4 DNA 連接酶將兩條相同的核酸適配體連接形成一種環(huán)二價核酸適配體。如圖 1.7B 所示，作者首先將特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM 的核酸適配體 Sgc8 的莖部分別延長部分堿基，通過堿基互補(bǔ)作用使綠色和紅色序列雜交，然后加入 T4 DNA 連接酶封閉缺口，從而構(gòu)建了一種環(huán)二價核酸適配體�；铙w熒光實(shí)驗(yàn)表明，相比于單價核酸適配體，，環(huán)二價核酸適配體能夠在腫瘤中更加有效地積累和保留，這種策略促進(jìn)了核酸適配體在活體水平上的應(yīng)用。除了將兩個或多個核酸適配體拼接在一起以外，還可以將裂開型核酸適配體的片段通過輔助序列拼接成激活式探針。如本課題組 Lei 等[60]將裂開型核酸適配體片段用一段連接序列拼接成一條序列，并標(biāo)記熒光染料，隨后與一條淬滅片段互補(bǔ)雜交，并將互補(bǔ)堿基對設(shè)計(jì)成 GC 配對以裝載藥物阿霉素（DOX），從而構(gòu)建了一種新型的診療一體化的裂開型 Aptamer 探針（圖 1.7C）。

碩士學(xué)位論文核酸適配體的 light-up 熒光探針具有操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)于其它成像技術(shù)（如熒光原位雜交、綠色熒光蛋白等），light-低，可免洗直接進(jìn)行檢測。核酸適配體可能穩(wěn)定了小分子的平過非輻射衰變途徑（如熱、分子運(yùn)動）消耗能量，從而使輻射、磷光）占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)[62]（圖 1.8）。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;R730.43

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本文編號：2620776