【摘要】：核酸適配體作為新興的識(shí)別分子,具有高親和力、高特異性、易合成修飾、設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于腫瘤診斷和治療等領(lǐng)域。然而,核酸適配體往往存在序列較長(zhǎng)、構(gòu)型設(shè)計(jì)復(fù)雜、標(biāo)記成本較高等缺點(diǎn),因此,對(duì)其進(jìn)行序列改造是非常有必要的。其中,通過(guò)對(duì)核酸適配體進(jìn)行裂分獲得的裂開(kāi)型核酸適配體,巧妙地彌補(bǔ)了以上的缺點(diǎn)。此外,基于核酸適配體的light-up熒光探針為發(fā)展高信背比、高特異性和免標(biāo)記的檢測(cè)方法提供了新的契機(jī)�；诖�,本論文以發(fā)展免標(biāo)記、低成本和高靈敏的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法為目標(biāo),通過(guò)對(duì)核酸適配體序列進(jìn)行裁剪、裂分和拼接,設(shè)計(jì)了一種雙功能裂開(kāi)型核酸適配體探針,以腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象,建立了兩種檢測(cè)方法。具體研究?jī)?nèi)容如下:一、雙功能裂開(kāi)型核酸適配體的構(gòu)建及其腫瘤細(xì)胞免標(biāo)記檢測(cè)研究利用人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的特異性核酸適配體與激活硫黃素T(ThT)熒光的核酸適配體,通過(guò)裁剪、裂分和拼接等過(guò)程,設(shè)計(jì)了一種新的雙功能裂開(kāi)型核酸適配體探針(BFSA)。BFSA與ThT混合后形成BFSA/ThT復(fù)合探針,此時(shí)ThT的熒光被激活。該復(fù)合探針能夠特異性結(jié)合靶細(xì)胞,通過(guò)洗滌去除多余探針,即可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞SMMC-7721的免標(biāo)記和低成本檢測(cè)。該探針在100μL結(jié)合緩沖液中最低檢測(cè)到了125個(gè)細(xì)胞,且實(shí)現(xiàn)了對(duì)20%人血清樣品中靶細(xì)胞的定量檢測(cè),此方法為腫瘤和醫(yī)學(xué)診斷研究提供了一種新的思路。二、靶標(biāo)介導(dǎo)組裝的light-up熒光探針用于腫瘤細(xì)胞的一步式檢測(cè)研究在上一個(gè)研究工作中,我們?cè)O(shè)計(jì)的BFSA雖然能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免標(biāo)記檢測(cè),但需要洗去未結(jié)合的探針來(lái)降低背景信號(hào),使得操作較為復(fù)雜。如果將BFSA的一個(gè)片段與一條互補(bǔ)序列雜交,先封閉熒光染料的激活區(qū)域,設(shè)計(jì)成一種激活式的熒光探針,有望解決以上問(wèn)題。鑒于此,我們建立了一種靶標(biāo)介導(dǎo)組裝的light-up熒光探針:在無(wú)靶標(biāo)時(shí),BFSA的兩個(gè)片段相互獨(dú)立,并且其與ThT結(jié)合的區(qū)域被封閉,因此熒光信號(hào)微弱;而當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí),則會(huì)誘導(dǎo)各片段的組裝,BFSA激活ThT熒光的功能恢復(fù),從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞SMMC-7721的免洗的一步式檢測(cè)。該探針在100μL結(jié)合緩沖液中可檢測(cè)到125個(gè)細(xì)胞,且在20%人血清樣品中具有良好的穩(wěn)定性。此外,該探針具有良好的選擇性,可明顯區(qū)分靶細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞。本方法只需將核酸適配體、熒光報(bào)告分子與靶標(biāo)混合便能產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào),實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的免洗、免標(biāo)記、低成本的一步式檢測(cè)。三、自動(dòng)化工作站輔助的人血管生長(zhǎng)素核酸適配體的篩選研究在以上研究工作中,我們發(fā)現(xiàn)并非所有的核酸適配體都適合設(shè)計(jì)成裂開(kāi)型探針,因此,篩選更多的核酸適配體對(duì)解決這一問(wèn)題顯然是有幫助的。然而,經(jīng)典的篩選方法過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力,非常有必要利用儀器設(shè)備來(lái)提高操作的自動(dòng)化程度。有鑒于此,我們將自動(dòng)化工作站引入到SELEX技術(shù)的操作流程中,以血管生長(zhǎng)素(ANG)為靶標(biāo)進(jìn)行核酸適配體的篩選。目前已將恒溫孵育、磁分離、單鏈制備與純化等操作集成在自動(dòng)化工作站上完成。經(jīng)過(guò)了12輪的篩選工作,一共選擇了16條序列做進(jìn)一步的表征。結(jié)果表明,Y8和Y18能夠特異性結(jié)合ANG,解離常數(shù)分別為108.4 nM和177.1 nM。隨后又對(duì)Y8和Y18進(jìn)行了序列優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)將前后引物去掉后的Y8-1和Y18-1對(duì)ANG的結(jié)合能力并沒(méi)有因此被削弱。有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)截短后Y8-1和Y18-1還具有增強(qiáng)Hemin催化過(guò)氧化氫分解的能力,甚至比已知的G-四聚體序列Dz-11更強(qiáng)。因此,我們篩選得到的兩條核酸適配體不僅能夠用于識(shí)別ANG,還有望被用來(lái)發(fā)展基于脫氧核酶活性的檢測(cè)方法。
【圖文】：

建成一種二價(jià)核酸適配體。如圖 1.7A 所示，38-GC 是由三個(gè)雙鏈莖部（stem1,2和 3）和兩個(gè)環(huán)部（GAA 和 AAA）組成的三向連接結(jié)構(gòu)，中心為靶標(biāo)的結(jié)合區(qū)域，作者將 38-GC 裂成兩對(duì)不同的片段，其中莖部 3 保持原結(jié)構(gòu)，隨后將兩組裂開(kāi)的片段連接在一起，形成一種新的裂開(kāi)型二價(jià)核酸適配體 CBSA（短片段是 SF，長(zhǎng)片段是 LF）。此外，Tan 等[59]利用 T4 DNA 連接酶將兩條相同的核酸適配體連接形成一種環(huán)二價(jià)核酸適配體。如圖 1.7B 所示，作者首先將特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞CCRF-CEM 的核酸適配體 Sgc8 的莖部分別延長(zhǎng)部分堿基，通過(guò)堿基互補(bǔ)作用使綠色和紅色序列雜交，然后加入 T4 DNA 連接酶封閉缺口，從而構(gòu)建了一種環(huán)二價(jià)核酸適配體�；铙w熒光實(shí)驗(yàn)表明，相比于單價(jià)核酸適配體，，環(huán)二價(jià)核酸適配體能夠在腫瘤中更加有效地積累和保留，這種策略促進(jìn)了核酸適配體在活體水平上的應(yīng)用。除了將兩個(gè)或多個(gè)核酸適配體拼接在一起以外，還可以將裂開(kāi)型核酸適配體的片段通過(guò)輔助序列拼接成激活式探針。如本課題組 Lei 等[60]將裂開(kāi)型核酸適配體片段用一段連接序列拼接成一條序列，并標(biāo)記熒光染料，隨后與一條淬滅片段互補(bǔ)雜交，并將互補(bǔ)堿基對(duì)設(shè)計(jì)成 GC 配對(duì)以裝載藥物阿霉素（DOX），從而構(gòu)建了一種新型的診療一體化的裂開(kāi)型 Aptamer 探針（圖 1.7C）。

碩士學(xué)位論文核酸適配體的 light-up 熒光探針具有操作方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)于其它成像技術(shù)（如熒光原位雜交、綠色熒光蛋白等），light-低，可免洗直接進(jìn)行檢測(cè)。核酸適配體可能穩(wěn)定了小分子的平過(guò)非輻射衰變途徑（如熱、分子運(yùn)動(dòng)）消耗能量，從而使輻射、磷光）占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)[62]（圖 1.8）。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.3;R730.43

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本文編號(hào)：2620776