發(fā)布時(shí)間：2020-04-09 04:44

【摘要】：研究背景和目的:膀胱癌(BCa)術(shù)后容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,可能與“腫瘤干細(xì)胞”(CSCs)未被有效地清除或殺滅有關(guān)。CSCs是腫瘤的惡性增殖、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、侵襲和耐藥等方面的根源。理想的治療方法應(yīng)該有效地殺滅CSCs。本課題組綜合運(yùn)用化療藥物加壓篩選聯(lián)合有限稀釋法和無(wú)血清培養(yǎng)基法分離并獲得了 MB49膀胱腫瘤干細(xì)胞。利用我們特有的細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)錨定技術(shù),制備了一種細(xì)胞膜錨定GM-CSF的腫瘤全細(xì)胞疫苗,包含了所有的腫瘤細(xì)胞抗原,而且還有能增強(qiáng)免疫作用的細(xì)胞因子。這種疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤的免疫反應(yīng),有效地抵抗同種腫瘤細(xì)胞。這種腫瘤疫苗能有效地增加效應(yīng)性CD4+ T和CD8+T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫。但是在前期的研究中也發(fā)現(xiàn),無(wú)論經(jīng)過(guò)何種細(xì)胞因子修飾的腫瘤干細(xì)胞疫苗治療后,部分小鼠皮下腫瘤不能完全消退,或者經(jīng)歷開(kāi)始的消退后,再次生長(zhǎng)。根據(jù)目前腫瘤免疫學(xué)的研究進(jìn)展,機(jī)體在激活正性的抗腫瘤免疫反應(yīng)的同時(shí),存在腫瘤的免疫逃逸。PD-1/PD-L1在調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中發(fā)揮著非常重要的作用,已成為近幾年免疫治療的研究熱點(diǎn)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),GM-CSF錨定腫瘤細(xì)胞疫苗組小鼠腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)量明顯增高,而且腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞表面的PD-1表達(dá)量明顯增多。因此,經(jīng)過(guò)GM-CSF錨定腫瘤細(xì)胞疫苗治療過(guò)的小鼠體內(nèi)存在因PD-1/PD-L1通路激活而導(dǎo)致的免疫逃逸。我們?cè)O(shè)想:利用膜修飾GM-CSF的腫瘤干細(xì)胞疫苗以充分激活抗原提呈細(xì)胞,并促進(jìn)腫瘤抗原的提呈,促進(jìn)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖,從而能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng);在此基礎(chǔ)上,如果能通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路,降低T細(xì)胞凋亡的發(fā)生,抑制相關(guān)免疫逃逸,很可能可以最大程度地誘導(dǎo)產(chǎn)生高強(qiáng)度、持久、特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果:1.膀胱腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒定采用化療藥加壓篩選聯(lián)合有限稀釋法和無(wú)血清培養(yǎng)法分離和培養(yǎng)MB49膀胱腫瘤干細(xì)胞(MCSCs)。檢測(cè)結(jié)果顯示,MCSCs中CD133+CD44+比例明顯高于MB49細(xì)胞;MCSCs中CD133、OCT4、NANOG的mRNA含量均明顯高于MB49細(xì)胞;MCSCs在體外和體內(nèi)均顯示出更強(qiáng)的增殖能力;MCSCs對(duì)臨床上常用的化療藥表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性。2.SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤干細(xì)胞疫苗的制備及其生物學(xué)活性檢測(cè)利用我們特有的蛋白質(zhì)錨定技術(shù)制備腫瘤干細(xì)胞疫苗,檢測(cè)顯示SA-GM-CSF能高效地錨定在細(xì)胞膜表面(98.7%),并且保持良好的生物學(xué)活性。3.SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤干細(xì)胞疫苗用于治療膀胱癌的療效及相關(guān)免疫逃逸機(jī)制的研究GM-CSF膜錨定的CSCs疫苗能有效地激活機(jī)體的殺傷CSCs的免疫反應(yīng)。但是,無(wú)論選用何種細(xì)胞因子修飾的MCSCs疫苗,部分小鼠皮下腫瘤不能完全消退,或者經(jīng)歷開(kāi)始的消退后,再次生長(zhǎng)。SA-GM-CSF膜修飾的MCSCs疫苗治療后的腫瘤微環(huán)境中PD-L1的表達(dá)上調(diào),CD8+PD-1+ T細(xì)胞的數(shù)量也增多,證實(shí)腫瘤微環(huán)境中存在PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫逃逸。4.PD-1阻斷聯(lián)合SA-GM-CSF膜修飾的膀胱腫瘤干細(xì)胞疫苗用于治療轉(zhuǎn)移性膀胱癌的治療效果及相關(guān)機(jī)制的研究(1)治療效果PD-1阻斷聯(lián)合GM-CSF膜錨定的CSCs疫苗能有效地抑制小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng),顯著增強(qiáng)機(jī)體靶向殺傷CSCs的能力,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CSCs的特異性免疫反應(yīng)。(2)聯(lián)合治療的相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制研究GM-CSF修飾的CSCs疫苗治療能有效地促進(jìn)DC的成熟。PD-1阻斷聯(lián)合GM-CSF修飾的CSCs疫苗能顯著增加效應(yīng)性CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,特別是增加了對(duì)CSCs有直接毒性的IFN-γ+CD8+T淋巴細(xì)胞,而并不增加免疫耐受性Treg細(xì)胞的數(shù)量和比例。腫瘤組織中浸潤(rùn)性CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯多于對(duì)照組。PD-1阻斷聯(lián)合CSCs疫苗能誘導(dǎo)分泌更高濃度的正性免疫活性細(xì)胞因子IL-12和IFN-y,而不增加負(fù)性免疫活性細(xì)胞因子IL-10的濃度。IFN-y在促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞上調(diào)PD-L1中起著重要作用。PD-1單抗可以明顯增強(qiáng)GM-CSF腫瘤細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)的CTL活性,增強(qiáng)其殺傷腫瘤干細(xì)胞的作用。結(jié)論:1.采用化療藥加壓篩選聯(lián)合有限稀釋法和無(wú)血清培養(yǎng)法分離和培養(yǎng)MB49膀胱腫瘤干細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)。2.SA-GM-CSF能高效地錨定在CSCs表面,且能保持良好的生物學(xué)活性。3.SA-GM-CSF膜修飾的CSCs疫苗能有效地促進(jìn)DCs的成熟,有助于腫瘤細(xì)胞抗原的識(shí)別,但是腫瘤微環(huán)境中存在PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫逃逸。4.在腫瘤干細(xì)胞疫苗治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用PD-1單抗,能誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生大量的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生大量激活免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子,增強(qiáng)機(jī)體殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,有效地抑制膀胱轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生和發(fā)展。
【圖文】：

逡逑者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｆ邋＝邋８４．２４８，邋Ｐ邋＝邋０．０００，圖１－５，表１－５）。ＭＣＳＣｓ逡逑對(duì)絲裂霉素具有更強(qiáng)的耐受能力。逡逑紫杉醇（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）：腫瘤干細(xì)胞的狀態(tài)隨著紫杉醇藥物濃度的增加而逐漸變逡逑差，死亡細(xì)胞也逐漸增多。結(jié)果證實(shí)：隨著紫杉醇的濃度由１０ｎＭ提高至１０ｕＭ，逡逑ＭＢ４９細(xì)胞的存活率由（８３．８７±９．３３）％下降至（３２．３０±３．９３）％，ＭＣＳＣｓ細(xì)胞的存逡逑活率由（９２．９７±２．９２）％下降至（７８．１３士８．０４）％，紫杉醇對(duì)膀胱癌細(xì)胞和膀胱癌干細(xì)逡逑胞均有殺滅作用。紫杉醇的濃度為１０ｎＭ低濃度時(shí)，ＭＣＳＣｓ和ＭＢ４９邋ｃｅｌｌｓ細(xì)胞逡逑存活率無(wú)差異，當(dāng)濃度為１００ｎＭ，邋ｌｕＭ，１０ｕＭ時(shí)，ＭＣＳＣｓ細(xì)胞的存活率明顯逡逑高于ＭＢ４９細(xì)胞

２８２７．８１２，尸組間＜邋０．０１；邋Ｆ濃度＝１８６．９４３，邋Ｐ濃度＜邋０．０１；邋Ｆ組間ｘ濃度＝９５．７１８，Ｐ組間ｘ濃度＜逡逑０．０１。分析結(jié)果提示：錨定在腫瘤干細(xì)胞表面的ＳＡ－ＧＭ－ＣＳＦ雙功能融合蛋白仍逡逑有效地促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞的增殖（Ｐ＜０．０５），且呈劑量依賴關(guān)系（圖２－２，表２－１）。逡逑３０逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14

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本文編號(hào)：2620305