【摘要】：聲動力療法(SonodynamicTherapy,SDT)是一種新型的癌癥治療方法,他的基本原理與光動力治療相似,利用聲敏劑可特異性濃聚在腫瘤組織的特性,超聲能使組織中的氧活化為單態(tài)氧,最終導致腫瘤細胞死亡。但是值得一提的是,跟光動力治療(Photodynamic Therapy,PDT)激光對組織的穿透力不同,超聲可以深入到組織中,這就為使用聲動力治療深部腫瘤組織提供了可能性。近來有研究報道PDT治療腫瘤具有腫瘤疫苗的特性,而SDT的作用機制與PDT相似,因此我們假設(shè),SDT也可以作為一種癌癥疫苗有效地發(fā)揮作用。因此,我們制定了一種治療策略,探討SDT能否消除原發(fā)性腫瘤,抑制轉(zhuǎn)移,防止腫瘤復發(fā)。目的:探討聲動力(SDT)治療肝癌小鼠的免疫學機制。方法:使用正交設(shè)計對聲敏劑濃度、超聲強度、超聲頻度及照射時間四因素三水平進行分組,共分為9組。采用MTT實驗法測定細胞生存率,流式細胞術(shù)測定腫瘤細胞的凋亡率及流式細胞術(shù)測定活性氧釋放量來選擇最佳參數(shù)組合。然后使用最佳參數(shù)組合,探討聲動力治療的免疫效應(yīng)。采用免疫熒光法和流式細胞術(shù)對體外培養(yǎng)的H22腫瘤細胞表面的鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)進行測定:建立H22小鼠腫瘤模型觀察SDT對H22小鼠腫瘤大小和對遠處(遠隔)腫瘤的抑制作用。使用ELISA測定各組血清IL-2、IFN-γ和IL-10水平。用免疫組化檢測CD4、CD8、CD68、CD163、FOXP3等標志在腫瘤組織中的表達情況。使用LDH釋放實驗來評估處理后小鼠脾細胞對H22和S180腫瘤細胞特異性殺傷能力及遠處腫瘤的免疫組化實驗證實聲動力引發(fā)的免疫特異性。結(jié)果:MTT實驗結(jié)果顯示:聲動力療效最好的參數(shù)組合是A2、B2、C3和D3;流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率結(jié)果顯示:聲動力療效最好的參數(shù)組合是A3、B3、C1、D3;流式細胞術(shù)測定活性氧釋放量結(jié)果示:HPD為20μg/ml時,聲動力產(chǎn)生的活性氧濃度最高,殺傷腫瘤細胞的能力最強,其余因素個水平無顯著特異性。綜合上述實驗結(jié)果顯示:聲動力最佳組合為超聲強度為1.0 W/cm2,聲敏劑濃度為20μg/ml,照射時間為30分鐘。由于超聲頻率三水平之間無明顯差異,因此對于超聲頻率在后續(xù)實驗中我們選擇使用50%。單次聲動力照射治療,療效較弱,因此我們選擇通過增加連續(xù)照射次數(shù),即延續(xù)照射時間,來達到增強療效的效果。結(jié)果顯示在連續(xù)輻照4周期(即照射時間為2小時),腫瘤大小明顯小于其他組(P = 0.001)。因此,聲動力在本實驗中的參數(shù)組合最后確定為:超聲強度為1.0 W/cm2,聲敏劑濃度為20μg/ml,超聲頻度為50%,照射時間為2h,并將應(yīng)用于后續(xù)實驗。探討聲動力治療的免疫效應(yīng)結(jié)果顯示:流式細胞技術(shù)和免疫熒光染色測定結(jié)果顯示:聲動力組(SDT)處理的H22細胞表面檢測到較單純超聲組、單純聲敏劑組及對照組有更顯著的CRT表達。聲動力組(SDT)對皮下腫瘤可觀察到明顯的抑制生長的作用,隨時間延長腫瘤逐漸變小,并且對遠處(遠隔)腫瘤的抑制作用。同時,6周期聲動力治療效果較4周期明顯,因此后續(xù)小鼠實驗均選用6周期聲動力治療。6周期聲動力治療后,小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平明顯高于其余三組的相應(yīng)細胞因子水平(P0.0001);相反,IL-10水平明顯低于其余三組水平(P0.0001)。在SDT的腫瘤組織中CD4、CD8、CD68的表達水平較高,CD163、FOXP3的表達水平較低。單因素方差分析顯示:組間差異顯著(CD4(P0.001);CD8(P0.001);CD68(P0.001);CD163(P = 0.005);和 FOXP3(P0.001))。LDH 釋放實驗顯示結(jié)論:對于H22腫瘤細胞,D組的脾細胞殺傷能力明顯高于其余三組(P0.0001),在效靶比為100:1(P0.0001)時,殺傷能力最強。而相反,對于S180,聲動力組的脾細胞的殺傷能力與其他組沒有明顯差異。小鼠的遠處腫瘤組織進行免疫組化結(jié)果顯示,聲動力組的小鼠中組織中出現(xiàn)明顯的CD4,CD8T細胞的浸潤。Image-pro+6.0對細胞的免疫陽性進行了定量分析顯示:各組間差異顯著(CD4 P0.001;CD8P0.001)。結(jié)論:SDT能產(chǎn)生有效的癌癥疫苗的潛力,可以抑制原發(fā)性和遠隔的腫瘤生長,值得做進一步深入研究。
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甚至導致其壞死，被認為聲動力殺傷腫瘤細胞的主要機制之一。因此，我們用逡逑ＤＣＦＨ－ＤＡ染色法對ＲＯＳ的產(chǎn)生進行分析，并使用流式細胞儀進行測定。與陰逡逑性對照組相比，實驗組Ｒ０Ｓ水平升高（圖２－３邋）。單因素方差分析結(jié)果顯示組間逡逑差異顯著（Ｐ＝0．00４）。單因素分析表明，Ｒ０Ｓ的產(chǎn)生主要是由ＷＤ濃度決定的逡逑（Ｐ＜０．００１）。對于ＨＰＤ濃度，Ａ３產(chǎn)生的活性氧濃度最高（ＲＯＳ＝７４．５０８），Ａ１水逡逑平分別于Ａ２和Ａ３水平均存在顯著性差異，而Ａ２和Ａ３之間沒有顯著差異。逡逑因此，ＨＴＯ為２０（＾／１１１１時，聲動力產(chǎn)生的活性氧濃度最高，，殺傷腫瘤細胞的能逡逑力最強。逡逑１６逡逑

圖２－３邋ＲＯＳ水平使用ＤＣＦＨ－ＤＡ測量
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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1 張震;夏春義;劉云會;薛一雪;;低頻超聲選擇性開放血腫瘤屏障的實驗性研究[J];中國超聲醫(yī)學雜志;2008年07期

本文編號：2618194