【摘要】：結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率高居男性癌癥發(fā)病率的第三位,和女性癌癥發(fā)病率的第二位。近年來,隨著診療技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展,早期結(jié)腸癌治療水平顯著提升。然而,對(duì)于晚期和轉(zhuǎn)移患者仍然缺乏有效治療手段。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療面臨的巨大挑戰(zhàn),據(jù)統(tǒng)計(jì),90%以上的癌癥死亡病人可檢測(cè)到腫瘤轉(zhuǎn)移。基因治療得到飛速發(fā)展,有望為腫瘤轉(zhuǎn)移治療帶來突破。深入闡明惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的機(jī)制,篩選腫瘤治療的潛在靶點(diǎn),是基因治療的關(guān)鍵與基礎(chǔ)。Spreds(Sprouty related with EVH1 domain)為一類與Sprouty相關(guān)的細(xì)胞膜蛋白,可負(fù)調(diào)控Ras-Raf-ERK信號(hào)通路。我們前期研究顯示,Spreds成員Spred2可調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelocytic leukemia,CML)和肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡,抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而,Spred2在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用及機(jī)制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)是一種多功能細(xì)胞因子,在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起著雙重作用:在腫瘤早期,TGFβ通過TGF-β/SMADs信號(hào)通路調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá),抑制增殖和促進(jìn)凋亡;在腫瘤晚期,TGFβ信號(hào)的異常激活,可與多條信號(hào)通路,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)通路和缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia inducible factor,HIF-1α)信號(hào)等發(fā)生cross-talk,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。更為重要的是,TGFβ能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT),促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明,TGFβ的下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路可受到RTK拮抗劑的負(fù)調(diào)控,而Spred2是RTK拮抗劑的一種。那么,Spred2能否通過TGFβ信號(hào)通路來影響腫瘤細(xì)胞的EMT和生物學(xué)性能呢?本課題旨在闡明Spred2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)性能的影響,并闡明其可能機(jī)制;同時(shí),探討Spred2與TGFβ信號(hào)通路在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞EMT中的作用,初步闡明Spred2調(diào)控EMT的可能機(jī)制,期望為結(jié)腸癌的治療提供更加有效的治療靶標(biāo)。首先,收集了2009年-2012年期間在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院手術(shù)的結(jié)腸癌患者腫瘤組織和癌旁組織,共31對(duì)。我們通過采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)方法,檢測(cè)了Spred1和Spred2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,結(jié)腸癌病人腫瘤組織中Spred2表達(dá)顯著下調(diào),而Spred1則無(wú)明顯改變,表明Spred2可能在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。其次,擴(kuò)增純化了表達(dá)Spred2的重組腺病毒Ad5/F11p.Spred2和對(duì)照病毒Ad5/F11p.Null。采用紫外分光光度法和極限稀釋法,測(cè)定了病毒的純度、顆粒滴度和感染滴度。結(jié)果顯示,Ad5/f11p.Spred2和Ad5/f11p.Null的純度分別為1.3521和1.4025,顆粒滴度分別為3.36×10~(11)VPs/mL和4.95×10~(11)VPs/mL,感染滴度分別為1.28×10~(10)IU/mL和2.5×10~(11)IU/mL,符合進(jìn)一步功能實(shí)驗(yàn)的要求。Real-time PCR和Western-blotting結(jié)果顯示,Ad5/F11p.Spred2可以高效介導(dǎo)Spred2在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HCT116中表達(dá)。上述結(jié)果表明,我們已成功制備了高質(zhì)量的病毒產(chǎn)品。再次,不同感染強(qiáng)度(25MOI、50MOI和100MOI)Ad5/F11p.Spred2和對(duì)照病毒Ad5/F11p.Null感染結(jié)腸癌細(xì)胞SW480后,于24h、48h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;50MOIAd5/F11p.Spred2和Ad5/F11p.Null感染SW480后0h,24h,48h,72h和96h,流式細(xì)胞檢測(cè)Dye670的熒光強(qiáng)度,分析細(xì)胞增殖活性;50MOI Ad5/F11p.Spred2和Ad5/F11p.Null感染SW480細(xì)胞后,采用劃痕實(shí)驗(yàn)以及穿孔實(shí)驗(yàn)(Transwell),檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的改變。結(jié)果顯示,Ad5/F11p.Spred2能夠促進(jìn)SW480細(xì)胞的凋亡,并成一定的劑量和時(shí)效依賴關(guān)系;能夠抑制SW480細(xì)胞的增殖和遷移。上述結(jié)果表明,Spred2高表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移,并促進(jìn)凋亡。然后,明確了TGF-β對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的作用。采用10ng/ml的重組人TGF-β因子刺激結(jié)腸癌細(xì)胞SW480,通過形態(tài)學(xué)觀察、Western-blotting、免疫熒光和激光共聚焦等方法檢測(cè)明確TGF-β對(duì)EMT的影響。我們發(fā)現(xiàn),TGF-β可促進(jìn)SW480細(xì)胞的遷移,并引起細(xì)胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變;下調(diào)上皮標(biāo)志分子E-cadherin的表達(dá),上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。與我們預(yù)期一致,TGF-β可促進(jìn)下游分子Smad2/3和Smad4的表達(dá)。上述結(jié)果提示,TGF-β在誘導(dǎo)SW480細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮重要作用,而TGF-β介導(dǎo)的EMT可能是促進(jìn)SW480細(xì)胞遷移的重要機(jī)制。最后,在不同遺傳背景的結(jié)腸癌細(xì)胞中,檢測(cè)了Spred2對(duì)TGF-β/SMADs信號(hào)通路及結(jié)腸癌細(xì)胞EMT的作用。50MOI Ad5/F11p.Spred2感染SW480細(xì)胞、24h和48h,收集蛋白,Western-blotting檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)記分子、TGF-β/SMADs和MAPK/ERK信號(hào)通路相關(guān)分子,以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄分子的表達(dá)。結(jié)果顯示,Ad5/F11p.Spred2可高效表達(dá)Spred2蛋白,有效抑制ERK磷酸化,但對(duì)Smad2/3和Smad4表達(dá)無(wú)明顯影響;能夠抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá),促進(jìn)E-cadherin的表達(dá),并抑制Vimentin的表達(dá),但對(duì)N-cadherin表達(dá)無(wú)明顯影響;免疫熒光細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步提示,Ad5/F11p.Spred2可抑制SW480的EMT。在HCT116細(xì)胞中,100MOI Ad5/F11p.Spred2感染不僅能夠抑制HCT116細(xì)胞ERK磷酸化,還可下調(diào)Smad2/3和Smad4蛋白的表達(dá);可以抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá),抑制EMT標(biāo)志蛋白Vimentin和N-cadherin的表達(dá)。上述結(jié)果表明,Ad5/f11p.Spred2可負(fù)性調(diào)控Ras-Raf-ERK信號(hào)通路和TGF-β/SMADs信號(hào)通路,進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT和遷移。綜上所述,Spred2在結(jié)腸癌病人組織中表達(dá)下調(diào),而Spred2高表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步研究表明,Spred2高表達(dá)能夠抑制Ras-Raf-ERK信號(hào)通路和TFG-β/SMADs信號(hào)通路,并抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT。因此,Spred2有望成為結(jié)腸癌治療的候選靶標(biāo)。
【圖文】：
紫溶液的孔中，進(jìn)行染色 20min。余燃料吸出，并用 PBS 清洗兩遍小室，再用無(wú)菌棉簽輕微擦，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，，觀察 9 個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)穿孔3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果癌患者腫瘤組織中 Spred1 和 Spred2 表達(dá)檢測(cè)2009 年-2012 年之間前往北京首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)腫瘤組織和癌旁組織，采用 real-time PCR 檢測(cè)了目的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，腫瘤組織中 Spred1 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而 Spred2 的表達(dá)顯著下調(diào)（p<0.01）。因此腸癌發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵分子。
.Spred2 感染 SW480 細(xì)胞后，real-time 檢測(cè)目的基因 Spred2 mR.Spred2，Ad5/F11p.Null 感染結(jié)腸癌 SW480 后，Spred2 蛋p.Spred2 和 Ad5/F11p.Null 感染結(jié)腸癌 SW480 后，于 24h 收過 Western-blot 檢測(cè)蛋白水平 Spred2 的表達(dá)。結(jié)d2 可在結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 中表達(dá)目的蛋白 Spred2。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.35
【相似文獻(xiàn)】
相關(guān)期刊論文 前10條
1 萬(wàn)曉龍;趙楠;景鵬瑞;魯曉嵐;董水瀅;史海濤;;miR-125a-3p調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2018年07期
2 尹宜海;劉霞;張守成;;華蟾素聯(lián)合三氧化二砷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用[J];江蘇醫(yī)藥;2017年15期
3 王立明,鄭靈,秦榮,張朝軍,馬丹,向佳梅;結(jié)腸癌細(xì)胞中氧自由基含量的臨床測(cè)定[J];重慶醫(yī)學(xué);2005年02期
4 樊代明,張學(xué)庸,陳希陶,胡家露,牟震先,陳寶軍,喬太東,朱明華,楊鴻兵,楊振東;抗結(jié)腸癌細(xì)胞單克隆抗體的制備及相應(yīng)抗原免疫組化鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1988年02期
5 周進(jìn)明;周琪;彭秋平;楊黎;李紅梅;梁后杰;;糖皮質(zhì)激素受體β表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞激素敏感相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)觀察[J];中華腫瘤防治雜志;2010年05期
6 張朝陽(yáng);徐克森;楊廣運(yùn);王金申;高穎;劉炎峰;帥晶;王家勇;李少燕;壽楠海;牛軍;;反義整合素β6基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞作用的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年37期
7 鄭見寶;祁杰;王訓(xùn)凱;李孝彬;王孝瓏;陳南征;余鈞輝;韓陽(yáng);孫學(xué)軍;;下調(diào)尾型同源盒基因-2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力的影響及其機(jī)制[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年04期
8 蔡文杰;王艷;隨力;王銘潔;;硫化氫促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2014年12期
9 田永剛;許軍;劉昶;;人工氣腹對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J];腹腔鏡外科雜志;2009年10期
10 林潔;黃瓊;來茂德;;5-氮-2′-脫氧胞苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2008年04期
相關(guān)會(huì)議論文 前10條
1 許峰;王杉;葉穎江;崔志榮;;腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷中的作用及機(jī)制[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年
2 王貴玉;王錫山;;激光捕獲微切割技術(shù)分離結(jié)腸癌細(xì)胞用于蛋白組學(xué)研究[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2005年
3 何向鋒;王建紅;譚清和;徐小紅;陸俊國(guó);楊磊;沈茜;徐薇薇;凌國(guó)杰;江棋;;肝竇內(nèi)皮細(xì)胞攝取結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體的熒光示蹤研究[A];第八屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第十三屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2014年
4 郭俊明;賴依峰;肖丙秀;劉瓊;;大豆異黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要集[C];2003年
5 沈丹;鄧長(zhǎng)生;;過氧化物酶體增殖物激活受體γ在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其激動(dòng)劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年
6 吳寒;王建春;汪玉霞;陳鵬宇;歐陽(yáng)靜萍;;γδT細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用研究[A];第十四屆全國(guó)腫瘤生物治療大會(huì)論文集[C];2015年
7 陳旭;林志烽;席文錦;王微;霍毅;楊安鋼;王濤;;MicroRNA-487b調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移及其機(jī)制研究[A];第十二屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2017年
8 王國(guó)強(qiáng);方m錁
本文編號(hào)：2618358
