【摘要】：“表觀可塑性”指的是細(xì)胞通過染色質(zhì)重塑改變基因表達(dá)譜,達(dá)到改變分化狀態(tài)的能力。表觀可塑性在胚胎干細(xì)胞(ESC)及組織多能干細(xì)胞中表現(xiàn)的最為明顯,一般發(fā)生于胚胎發(fā)育過程中,并受微環(huán)境誘導(dǎo)。最近越來(lái)越多的研究顯示,在腫瘤細(xì)胞中,也存在表觀可塑性,在外界環(huán)境的刺激下,這些細(xì)胞可以進(jìn)行重編程(reprogramming),表型發(fā)生轉(zhuǎn)變。~([1-4])一些高度惡性的腫瘤細(xì)胞可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的表觀可塑性,可以適應(yīng)不同的微環(huán)境,獲得耐藥能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力、免疫逃逸能力的改變。~([5])表觀遺傳調(diào)控體系-DNA甲基化、組蛋白乙酰化、核小體定位、miRNA表達(dá)等在表觀可塑性的形成中發(fā)揮了重要作用。~([6])在結(jié)腸癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了很多受雙向表觀遺傳學(xué)控制的基因,其中一部分為抑癌基因,啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化,是腫瘤發(fā)生的重要驅(qū)動(dòng)因素,而另外一部分與腫瘤細(xì)胞的代謝、耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),并表現(xiàn)出對(duì)微環(huán)境反應(yīng)的表觀可塑性。~([7-10])目前的研究大部分基于2D培養(yǎng),2D培養(yǎng)缺乏必要的細(xì)胞微環(huán)境,腫瘤細(xì)胞本身可能已經(jīng)發(fā)生了染色質(zhì)重塑、表型改變~([2])。有統(tǒng)計(jì)顯示,體外實(shí)驗(yàn)顯示有效的藥物,僅有5%在體內(nèi)顯現(xiàn)出抗腫瘤活性。而且2D培養(yǎng)細(xì)胞與3D培養(yǎng)細(xì)胞在增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物行為方面皆有很大的差異~([4])。為了探明微環(huán)境誘導(dǎo)的基因組甲基化改變,及其對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移等表觀可塑性的影響,我們做了如下的研究:1.首先,采用Matrigel膠3D on-top的方法成功構(gòu)建了人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和人大腸腺癌細(xì)胞系DLD-13D培養(yǎng)模型,這二者在3D培養(yǎng)下都可以突破接觸生長(zhǎng)抑制,6-8日后皆可以形成直徑大于100um的細(xì)胞球,MDA-MB-231 3D培養(yǎng)球呈Stellate形,細(xì)胞結(jié)合相對(duì)疏松,而DLD-1 3D培養(yǎng)細(xì)胞球呈Mass形,細(xì)胞之間結(jié)合緊密;2.采用皮下腫瘤組織塊原位移植的方法成功構(gòu)建乳腺癌和大腸癌的原位模型,術(shù)后約6-8周在免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪墊和結(jié)腸黏膜下,乳腺癌和大腸癌腫瘤組織皆可生長(zhǎng)至直徑接近1cm。對(duì)這兩個(gè)細(xì)胞系形成的2D、3D、原位癌模型進(jìn)行如下的檢測(cè),來(lái)探究腫瘤細(xì)胞微環(huán)境反應(yīng)性表觀可塑性;2.針對(duì)Ki-67進(jìn)行免疫熒光染色,可見腫瘤細(xì)胞在3D培養(yǎng)下增殖速率要遠(yuǎn)小于2D模型;3.采用相對(duì)定量MSP(Q-MSP)檢測(cè)乳腺癌和大腸癌中腫瘤發(fā)生相關(guān)基因甲基化水平變化,如BRCA1、CDH1、CDKN2A、PTEN、RASSF1、RUNX3、MLH、MGMT等,發(fā)現(xiàn)這些基因甲基化譜并未因微環(huán)境的改變而發(fā)生變化;采用RT-PCR的方法檢測(cè)這些基因的mRNA水平,進(jìn)一步驗(yàn)證了這些基因在2D、3D、原位癌中無(wú)轉(zhuǎn)錄水平差異;4.采用Illuminum Infinium Human Methylation 450K BeadChip芯片檢測(cè)全基因組甲基化,GO分析和KEGG分析顯示MDA-MB-231 3D、原位癌與2D培養(yǎng)之間主要的甲基化差異譜為多細(xì)胞組織形成相關(guān)基因,如HOXC4和HOXC5,而DLD-1 3D、原位癌與2D培養(yǎng)之間主要的甲基化差異譜為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因,如chloride channel、sodium channel、Potassium channel,GABA receptor,solute carrier family等。兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行3D培養(yǎng)后差生的甲基化差異譜絕大多數(shù)不同,但是兩個(gè)細(xì)胞系原位癌模型中甲基化差異譜有很多相同,如腫瘤發(fā)生相關(guān)基因、CDK2、CDK6、cyclin D1、Wnt(1、3、5、6、7、10、11)、BCL-2相關(guān)調(diào)往抑制因子、FGF、信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子、collagenⅣ、laminin等;5.采用Wstern Blot方法對(duì)比DLD-1 2D和3D培養(yǎng)細(xì)胞中N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平,顯示N-cadherin和vimentin表達(dá)增高,說明腫瘤EMT能力增強(qiáng);6.通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞比例,發(fā)現(xiàn)DLD-1 3D培養(yǎng)后,干細(xì)胞比例并無(wú)增高;但是RT-PCR顯示SOX2 mRNA水平增長(zhǎng)達(dá)百倍以上,說明腫瘤細(xì)胞仍然獲得了更強(qiáng)的多能性;7.通過RT-PCR檢測(cè)重要耐藥基因的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)bcl-2、top-1、ABCC1、ABCC2、ABCC6、MDR mRNA水平在在原位癌模型中明顯增高,且通過甲基化芯片檢測(cè)結(jié)果可見上述基因的甲基化狀態(tài)在原位癌中也多數(shù)有改變。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,第一:乳腺癌及大腸癌細(xì)胞在3D培養(yǎng)及形成原位癌后,與腫瘤發(fā)生相關(guān)的抑癌基因的甲基化狀態(tài)并無(wú)改變;第二:乳腺癌和大腸癌細(xì)胞皆明顯表現(xiàn)出針對(duì)微環(huán)境的表觀可塑性,DNA甲基化在其中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,體現(xiàn)在如下幾方面,1.不同的細(xì)胞系會(huì)根據(jù)自身生存需要采取相應(yīng)的表型改變,MDA-MB-231 3D培養(yǎng)細(xì)胞中多細(xì)胞形成基因甲基化改變,利于松散聯(lián)系的細(xì)胞形成腫瘤組織,DLD-1 3D培養(yǎng)細(xì)胞中跨膜通道相關(guān)基因甲基化改變,利于緊密連接的細(xì)胞之間進(jìn)行離子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送;2.形成原位癌后,乳腺癌和大腸癌中的基因甲基化改變多達(dá)幾千個(gè),而且很多存在很多相同改變。首先腫瘤相關(guān)基因甲基化改變,使腫瘤獲得更強(qiáng)的增殖和克隆演變能力。其次多個(gè)耐藥基因的甲基化及mRNA水平改變,使腫瘤獲得了更強(qiáng)的藥物代謝能力及耐藥性,再次,與EMT過程相關(guān)的cadherin和Vimentin等基因甲基化及表達(dá)水平在3D培養(yǎng)和原位癌中皆有明顯變化,使腫瘤獲得更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。綜上所述,我們的實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)盡可能基于3D或者原位癌模型,并努力完善3D培養(yǎng)模型,使之更接近于實(shí)際微環(huán)境;乳腺癌和大腸癌腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的表觀可塑性,基因甲基化是其中重要的調(diào)控機(jī)制,其中的某些關(guān)鍵途徑,可能為協(xié)同抗腫瘤治療提供靶點(diǎn)。
【圖文】：

3D 培養(yǎng)的細(xì)胞通過 β-整合素（橘黃色）與周圍培養(yǎng)環(huán)境形sell 實(shí)驗(yàn)室初次證明了在漂浮的膠原蛋白凝膠之上培養(yǎng)的細(xì)胞基底膜，這些基底膜對(duì)分子對(duì)組織特異性結(jié)構(gòu)和功能是至關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)的一種形態(tài)，富含膠原蛋白Ⅳ和組織特異性層粘上皮細(xì)胞下層，和上皮細(xì)胞及其他細(xì)胞近期直接接觸。在體于沿基底膜的極性組織的形成。Laminin-111 是胚胎和乳腺腺要成分，往往在組織細(xì)胞基底部多聚化形成信號(hào)傳導(dǎo)架構(gòu)。使上述架構(gòu)更穩(wěn)定。（圖 1.2）很多科學(xué)家希望能人工合成更接近每種細(xì)胞真實(shí)的細(xì)胞外環(huán)境。Plachot 等發(fā)現(xiàn)能使 S1管結(jié)構(gòu)的是那些能膠化并且富含 laminin-111 的提取物。

圖 1.2 基底膜結(jié)構(gòu)的組成（a）laminin-111 (綠色)多聚化，并與細(xì)胞表面的 integrins（藍(lán)色）多聚化的 laminin-111 不能形成超分子結(jié)構(gòu)，不夠穩(wěn)固，所以培養(yǎng)細(xì)極性，所以緊密結(jié)合蛋白（粉色）不能再細(xì)胞的極性端形成緊密連接化 laminin-111 (綠色)被 type IV collagen（紅色）錨鏈，其間經(jīng)過巢蛋形成穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)（黃色），此時(shí) integrins（藍(lán)色）可以形成極性分胞與之進(jìn)行信息交互后，形成正確的極性腺管。雖然雞胚胎基底層結(jié)構(gòu)含有 collagen Ⅳ和 laminin-111，但是并不能基底膜或者細(xì)胞極性形成，因?yàn)槠洳荒苣z化。越來(lái)越多的證據(jù)表明密度同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要的影響。[17]近期的研究表的整合素受體及可變形的細(xì)胞骨架會(huì)感知培養(yǎng)模型的致密度，并相
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.9;R735.34

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本文編號(hào)：2616956