【摘要】：目的:舌鱗狀細胞癌(Tougue squamous cell carcinoma,TSCC)是頭頸頜面部一種常見的惡性腫瘤,具有高侵襲性的生長方式和早期淋巴結轉移的特性。盡管舌癌的治療包括手術、放療和化療已取得了重大進展,但因舌鱗癌手術采取舌體擴大切除及選擇性頸淋巴結清掃,術后常造成患者的咀嚼和言語等功能障礙和面部容貌的畸形,極大地影響患者術后的生存質量和心理健康。新的治療方法如基因治療、靶向治療和生物治療等因有可以選擇性地作用于腫瘤細胞而極少損傷人體正常細胞的優(yōu)勢越來越受到人們的關注。舌鱗狀細胞癌的生長、侵襲和轉移不僅取決于腫瘤細胞本身的特性,還依賴于腫瘤細胞所處的微環(huán)境中的一些因素。因此,影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境因素成為現(xiàn)階段腫瘤治療的研究熱點。炎癥與腫瘤的關系在腫瘤學的研究中越來越受到重視。腫瘤微環(huán)境里存在的炎癥調節(jié)因子能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如其可以促進惡性腫瘤細胞的生長,加快其分裂增殖,促血管增生和腫瘤細胞的侵襲轉移,并且降低機體的固有性免疫和獲得性免疫能力,改變機體對激素和化療藥物的敏感性。微環(huán)境中的炎癥介質如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、干擾素等對腫瘤細胞的生長增殖、侵襲、遷移和凋亡具有重要的調控作用。炎癥調節(jié)因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要的調控作用使得炎癥介質成為腫瘤治療的重要靶點。如同其它炎癥介質,C反應蛋白(C reactive protein,CRP)是一種機體發(fā)生各種急慢性炎癥或受到損傷后的敏感的急性時相反應蛋白。CRP在肝臟中合成后通過血液循環(huán)分泌到各個組織器官,通過與配體結合來識別多種內源性(如壞死衰老癌變的細胞)和外源性物質(如細菌)而顯現(xiàn)出大量的生物活性。CRP與感染性炎癥及心血管系統(tǒng)疾病密切相關�，F(xiàn)階段國內外很多學者研究發(fā)現(xiàn),癌癥患者血清中CRP的濃度明顯高于正常人,其濃度升高的程度與腫瘤大小、臨床分期及病理分型有一定的相關性,而且CRP血清水平還與治療療效和術后復發(fā)率有關。然而現(xiàn)階段對CRP的研究僅限于血清中CRP的濃度與腫瘤關系的統(tǒng)計學研究,腫瘤微環(huán)境中的CRP對腫瘤細胞的直接作用研究很少。因此,本課題以CRP為靶因子,利用免疫組織化學研究CRP在舌鱗癌組織和細胞中的表達分布情況,并將外源性的重組人CRP與舌鱗癌細胞共培養(yǎng),采用CCK-8(Cell counting kit-8)、Transwell 小室、劃痕實驗、Annexin V-FITC/PI 雙染、Western Blot及免疫共沉淀等技術研究其對舌鱗癌細胞生長增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為的影響及其介導的信號轉導通路和分子調節(jié)機制,以期為舌鱗癌的臨床治療提供新的治療思路和實驗數(shù)據(jù)。材料與方法:本課題分為三部分:第一部分:研究CRP在舌鱗狀細胞癌組織和細胞中的表達實驗一:CRP在舌鱗狀細胞癌組織中的表達收集舌鱗癌組織42例,制作石蠟切片,梯度酒精入水,0.1%胰酶消化液抗原修復,滴加3%雙氧水,正常山羊血清封閉,CRP抗體4℃濕盒孵育過夜。滴加生物素化二抗工作液和鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶。DAB顯色,蘇木素復染,脫水,封片。用Image Pro Plus 6.0軟件測定累積光密度(IOD SUM)及目標區(qū)域面積(area),計算平均光密度值(mean density),mean density=(IOD SUM)/area。收集并整理每個患者的臨床資料,采用單因素方差分析或t檢驗進行統(tǒng)計學分析。實驗二:CRP在舌鱗狀細胞癌細胞中的表達1.舌鱗癌細胞分泌CRP的研究CAL27、SCC4及SCC25細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測培養(yǎng)基中CRP的含量。2.Western blot檢測舌鱗癌細胞中CRP的表達CAL27、SCC4及SCC25細胞常規(guī)培養(yǎng)24h,提取細胞總蛋白,蛋白含量測定,SDS-PAGE電泳,轉膜,免疫反應,顯影。第二部分:研究CRP對舌鱗癌細胞生長增殖、侵襲、遷移和凋亡等生物學行為的作用1.CCK-8檢測細胞增殖在96孔板中加入細胞(CAL27和SCC4細胞)懸液(100μl/孔,細胞密度為3.5×104個/ml),檢測CRP效應濃度實驗采用含有不同濃度CRP(0、5、10、20、30 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)細胞24 h。檢測CRP作用時間實驗采用含有不同濃度(5、10、20μg/ml)CRP 的 DMEM,分別培養(yǎng)細胞 48、36、24、12、6、0h。每孔中加入10μlCCK-8溶液,用酶標儀測定每孔的吸光度值。2.Transwell小室檢測細胞侵襲CAL27細胞在無血清的培養(yǎng)基中饑餓24 h,同化處理。在培養(yǎng)室的上腔分別加入200 μμl細胞懸液(細胞密度為4×105個/ml),下腔中分別加入無血清、含10μμg/ml CRP及10%FBS的DMEM各500μ1,培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定,結晶紫染色,倒置顯微鏡下計數(shù)。3.劃痕實驗檢測細胞遷移在6孔板中加入CAL27細胞懸液(2 ml/孔,細胞密度為4×105個/ml),待細胞生長融合至90%時,用200 μl的槍頭在每孔底部劃痕。每孔中加入不同條件的培養(yǎng)基(無血清DMEM、無血清DMEM+CRP(10 μg/ml)、含有10%FBS DMEM),分別在0、6、12、18h時取樣,拍照,測量。4.Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡在6孔板中加入CAL27和SCC4細胞懸液,采用不同條件的培養(yǎng)基(無血清DMEM、無血清DMEM+CRP(10μg/ml);正常培養(yǎng)基、含CRP的正常培養(yǎng)基、含順鉑(Cisplatin,DDP;2 μg/ml)的正常培養(yǎng)基、含DDP和CRP的正常培養(yǎng)基)培養(yǎng)24 h。按照凋亡檢測試劑盒說明書加入凋亡試劑后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。5.Western blot 檢測細胞核增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達在6孔板中加入CAL27細胞懸液,采用含有CRP(10 μg/ml)的培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)48、36、24、12、6、Oh。采用Western blot檢測PCNA的表達變化。第三部分:研究CRP作用舌鱗癌細胞過程中可能結合的受體及激發(fā)的信號調節(jié)通路實驗一:CRP作用舌鱗癌細胞CAL27過程中可能結合的受體1.免疫熒光染色檢測CAL27細胞表面受體的表達細胞爬片,4%多聚甲醛固定,0.2%Triton X 100通透,血清封閉液封閉,滴加一抗(Fcγ Ⅰ、FcγⅡ、FcγⅢ)4℃濕盒孵育過夜。暗室中滴加熒光二抗和DAPI,封片,熒光顯微鏡下觀察。2.免疫共沉淀檢測CRP與CAL27細胞表面受體的結合細胞生長融合至100%時,實驗組加入CRP(25 μg/ml)孵育30 min,對照組中加入PBS。裂解細胞提取蛋白,加入兔來源的CRP抗體后,再加入Agarose A/G進行結合反應,蛋白變性。采用Westernblot檢測所形成的免疫復合物。實驗二:CRP作用舌癌細胞CAL27過程中所激發(fā)的AKT/mTOR/S6信號通路的研究1.Western Blot檢測AKT/mTOR/S6信號通路蛋白的表達變化在6孔板中加入細胞懸液,待細胞生長融合至70%左右后,采用含有CRP(10μg/ml)的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細胞 0、15、30、60、120 和 0、30、60、120、180、240 min。采用 Western Blot 檢測 pAKT、pmTOR、pS6、pNF-KB、pERK 蛋白的表達變化。2.CCK-8檢測在培養(yǎng)基中加入mTOR的抑制劑-雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)后細胞的增殖狀況在96孔板中加入細胞懸液,采用含有不同成分的培養(yǎng)基(DMEM+DMSO,DMEM+CRP,DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA),培養(yǎng) 48、36、24、12、6、0h。采用CCK-8檢測細胞的增殖狀況。雷帕霉素(RAPA)的終濃度為2 μm/L。3.Western Blot檢測在培養(yǎng)基中加入雷帕霉素后PCNA的表達變化常規(guī)細胞鋪板,加入含有不同成分(DMEM+DMSO,DMEM+CRP,DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。Western Blot 檢測 PCNA的表達變化。實驗三:CRP作用舌癌細胞CAL27過程中所激發(fā)的Caspase 3/9凋亡信號通路的研究常規(guī)細胞鋪板,分別加入含2 μg/ml DDP和PBS、含2 μg/ml DDP、含2 μg/ml DDP和10 μg ml CRP 的 DMEM,培養(yǎng) CAL27 細胞 24 h。Western Blot 檢測Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 的表達變化。結果:1.CRP在舌鱗癌組織中呈陽性表達,而且舌鱗癌細胞可能產(chǎn)生及分泌CRP1.1.CRP在癌旁正常組織中無表達,在舌鱗癌組織中呈陽性表達免疫組織化學結果顯示,CRP在癌旁正常組織中無表達,在舌鱗癌組織中呈現(xiàn)陽性表達,CRP主要表達于癌細胞的細胞質中。CRP的表達強弱與腫瘤大小、病理分型及有無淋巴結轉移有關,而與年齡、性別無關。CRP在中低分化的舌癌組織中表達強于在高分化的舌癌組織中,而且,CRP在有淋巴結轉移的舌癌組織中表達更強。1.2.舌鱗癌細胞可能產(chǎn)生及分泌CRPELISA結果顯示不同舌鱗癌細胞系培養(yǎng)基中均含有不同含量的微量CRP,而在無細胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到CRP。Western Blot結果顯示在不同舌鱗癌細胞中都有CRP的表達。2.CRP促進舌鱗癌細胞的增殖、侵襲和遷移,降低饑餓和DDP誘導的舌癌細胞的凋亡CCK-8結果顯示CRP能明顯促進CAL27和SCC4細胞的增殖,并呈劑量及時間依賴性。CRP濃度在5μg/ml和10 μg/ml時對細胞的促增殖作用逐漸增加,在10 μg/ml時其對細胞的促增殖作用最明顯,增加CRP濃度至20 μg/ml和30 μg/ml時,其增殖效果無明顯增加。采用濃度為5、10和20 μg/ml CRP作用舌癌細胞24 h時增殖作用最明顯,隨著作用時間延長至36 h和48 h,CRP的促增殖效應減低。Western Blot結果顯示PCNA在10μg/ml CRP作用24 h時表達量最高。Transwell小室和劃痕實驗顯示CRP能明顯促進舌癌細胞CAL27的侵襲和遷移。10 μg/ml CRP作用舌癌細胞24 h后,穿過多聚碳酸膜的細胞數(shù)明顯多于陰性空白對照組。10μg/mlCRP作用舌癌細胞6h、12h和18h后,細胞遷移的距離分別是空白對照組的1.3、2和1.5倍。Annexin V-FITC/PI雙染顯示10 μg/ml CRP作用舌癌細胞CAL27和SCC4細胞24 h后,饑餓和DDP誘導的細胞凋亡率降低了接近50%。3.CRP可以結合CAL27細胞表面的Fcγ Ⅰ受體,上調AKT/mTOR/S6增殖信號通路,下調Caspase-3/9凋亡信號通路3.1.CRP可以結合CAL27細胞表面的Fcγ Ⅰ受體免疫熒光顯示CAL27細胞表面表達FcγⅠ、FcγⅡ和FcγⅢ受體。免疫共沉淀顯示CRP可以結合Fcγ Ⅰ受體形成復合物蛋白沉淀。3.2.CRP可以上調AKT/mTOR/S6增殖信號通路Western blot 結果顯示 10 μg/ml CRP 作用 CAL27 細胞到 15、30、60 min 時,pAKT和pmTOR表達逐漸升高,pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值逐漸升高,當作用時間延長至120 min時,pAKT和pmTOR表達下調,pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值降低。CRP作用到30 min時,pS6表達上調,pS6/S6的值升高近0.5倍,當作用時間延長至60 min和120 min時,pS6表達減少,pS6/S6的值降低。pNF-KB在CRP作用過程中表達量沒有明顯變化。在CRP的作用時間從0 min延長至240 min時,pERK/ERK逐漸降低。在培養(yǎng)基中加入雷帕霉素后,CCK-8結果顯示細胞的增殖明顯低于只加入CRP組。Western Blot結果顯示加入雷帕霉素組,PCNA蛋白的表達量明顯低于CRP組。3.3.CRP可以下調Caspase-3/9凋亡信號通路Western Blot結果顯示加入CRP培養(yǎng)24 h后,Cleaved Caspase-3蛋白的表達減少,Cleaved PARP和Cleaved Caspase-9蛋白的表達也減少。結論:1.CRP可能在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的促進作用。2.CRP能促進舌鱗癌細胞的增殖、侵襲和遷移,降低饑餓和DDP誘導的舌癌細胞的凋亡率。3.CRP可能通過結合舌癌細胞表面的Fcγ Ⅰ受體來影響舌癌細胞的生物學行為。4.CRP可能通過AKT/mTOR/S6信號通路促進舌癌細胞CAL27的增殖,從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。5.CRP可能通過減少Caspase-3/9蛋白的活化降低DDP誘導的CAL27細胞的凋亡率。
【圖文】：

邐山東大學博士學位論文邐逡逑結果逡逑１．ＣＲＰ在癌旁正常舌體組織及舌癌組織中的表達逡逑免疫組化結果顯示ＣＲＰ在正常舌體組織中無表達，而在舌癌組織中呈陽性逡逑表達，但表達強弱不一致。ＣＲＰ陽性反應物呈棕黃色或棕褐色顆粒樣沉積，主逡逑要沉積于細胞質中（圖１－１）。逡逑

ＥＬＩＳＡ結果顯示不同舌癌細胞系培養(yǎng)基中含有不同含量的微量ＣＲＰ而在無逡逑細胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到ＣＲＰ。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ結果顯示在不同舌鱗癌細胞中都逡逑有ＣＲＰ蛋白的表達（圖１－２）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑０．１０－１逡逑＿邋０．０８－邐＿ｍ＿邐ＣＡＬ２７邋ＳＣＣ４邋ＳＣＣ２５逡逑ｇ邋０．０６－逡逑＾邐ｍｍｍ邋ＣＲＰ逡逑0．０２＿邐１邋＂Ｔ邋｜邐Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑0．00Ｊ——，邐邐，，一＂￣■邋■邋ｒ」—逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＣＡＬ２７邋ＳＣＣ４邋ＳＣＣ２５逡逑圖１－２．舌淲癌細胞可以分泌ＣＲＰ。（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ結果顯示不同舌癌細胞系培養(yǎng)基中含有不逡逑同含量的微量ＣＲＰ而在無細胞的培養(yǎng)基中沒有檢測到ＣＲＰ。（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ顯示在不同逡逑舌癌細胞中都有ＣＲＰ蛋白的表達。逡逑３５逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.86

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 高翔,左桂蘭,郭林;血清C反應蛋白在惡性腫瘤中的臨床應用[J];診斷學理論與實踐;2004年01期

2 蔣曉婷,陳永健,劉建棟;血清C反應蛋白水平預測胃癌惡性程度的研究[J];腫瘤學雜志;2001年05期

本文編號：2615958