【摘要】：背景:在歐洲和美洲,前列腺癌(Prostate cancer,PCa)都是比較多見的男性惡性腫瘤之一。過去十年間,國內(nèi)前列腺癌的患病率和死亡率持續(xù)增長。盡管近年來前列腺癌的診斷治療有了很大的進(jìn)步,但晚期前列腺癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后仍然不甚理想。探尋敏感性更高的腫瘤分子標(biāo)記物,研究其參與前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展的分子機(jī)制,尋找分子水平診治前列腺癌的靶點(diǎn)是當(dāng)前前列腺癌研究的熱點(diǎn)。近年來,多項(xiàng)研究表明microRNA廣泛參與前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,是目前前列腺癌分子機(jī)制研究熱點(diǎn)之一。MicroRNA在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中起到非常關(guān)鍵的作用,而這些過程出現(xiàn)異常往往是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的重要原因。在肺癌、乳腺癌等的研究中表明,microRNA甚至可作為診斷疾病生物學(xué)靶標(biāo),對疾病的診斷、治療具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。盡管microRNA有望成為腫瘤早期診斷、病理分級及評價(jià)預(yù)后的重要指標(biāo),但至今仍然有很多microRNA的作用尚未被發(fā)現(xiàn),大部分microRNA的具體生物學(xué)功能還不十分清楚。異常表達(dá)的microRNA可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié),亦可以用于疾病的監(jiān)測、診斷和治療,因此microRNA具有重要的應(yīng)用前景。研究證實(shí)前列腺癌中有很多的microRNA表達(dá)發(fā)生異常,有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在前列腺癌中microRNA-125b和let-7的表達(dá)下調(diào),其表達(dá)譜和前列腺癌的分級有相關(guān)性,另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),microRNA-17-3p能夠?qū)η傲邢侔┑陌l(fā)展有抑制作用,在惡性程度較高的前列腺癌中其表達(dá)顯著減少。另外有研究表明轉(zhuǎn)移性的前列腺癌中microRNA-221表達(dá)下調(diào),似乎與前列腺癌的侵襲能力有相關(guān)性,其在未來可能作為前列腺癌侵襲能力的標(biāo)記物而應(yīng)用。這些都提示microRNA與前列腺癌的發(fā)病機(jī)制有密切的聯(lián)系。microRNA-212位于人類的17p13.3染色體,microRNA-212在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在胃癌、頭頸部惡性腫瘤、非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌以及肝癌中,均存在microRNA-212明顯表達(dá)異常。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),microRNA-212可能參與了腫瘤的調(diào)控。在我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),microRNA-212在前列腺癌組織中的表達(dá)與正常組織相比顯著降低,但其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。目的:1.檢測microRNA-212在前列腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)情況;研究microRNA-212與前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的關(guān)系;2.根據(jù)生物信息分析,對microRNA-212潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測并驗(yàn)證,探討microRNA-212對前列腺癌的調(diào)控機(jī)制。方法:1、收集前列腺癌組織以及癌旁組織標(biāo)本,采用qRT-PCR的方法,檢測microRNA-212在前列腺癌組織中的表達(dá),并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系。2、體外培養(yǎng)DU145、PC3、22RV1和LNCaP四種人類前列腺癌細(xì)胞系及正常前列腺上皮細(xì)胞系(RWWPE-1),采用qRT-PCR的方法檢測四種前列腺癌細(xì)胞系及正常前列腺上皮細(xì)胞系中microRNA-212的表達(dá)情況。3、為了進(jìn)一步研究microRNA-212在前列腺癌中的生物學(xué)作用,在DU145和PC3 兩種細(xì)胞中,分別轉(zhuǎn)染 microRNA-212 mimics、microRNA-212 inhibitor 或者NC陰性對照物。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率,并通過MTT檢測細(xì)胞增殖活性、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力、流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡情況。4、采用TargetScan以及microRNAanda進(jìn)行生物信息學(xué)分析microRNA-212潛在的靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAPK1是否為microRNA-212的靶基因并參與細(xì)胞功能的調(diào)控。5、通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),構(gòu)建異體移植瘤模型,檢測體內(nèi)上調(diào)microRNA-212對前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果:1、前列腺癌腫瘤組織中的microRNA-212表達(dá)顯著低于癌旁組織。前列腺癌細(xì)胞系(DU145、PC3、22RV1和LNCaP)中microRNA-212較正常前列腺上皮細(xì)胞系(RWPE-1)中的表達(dá)低。結(jié)合臨床資料分析,microRNA-212的表達(dá)與Gleason評分、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2、在 DU145 和 PC3 兩種細(xì)胞系中,轉(zhuǎn)染 microRNA-212 mimics、microRNA-212 inhibitor或者NC陰型對照物。通過MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染了 microRNA-212 mimics的DU145和PC3細(xì)胞,其增殖率降低,同時(shí)mmicroRNA-212的上調(diào)抑制了 DU145和PC3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。轉(zhuǎn)染了microRNA-212 inhibitor的DU145和PC3細(xì)胞則表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了 microRNA-212 mimics的DU145和PC3細(xì)胞的凋亡顯著增加,轉(zhuǎn)染了 microRNA-212 inhibitor的DU145和PC3細(xì)胞凋亡受到抑制。3、TargetScan 及 microRNAanda 分析顯示,MAPK1 是 microRNA-212 可能的作用靶點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示,microRNA-212顯著降低了pmicroRNAGLO-MAPKl-3'-UTR Wt 的熒光素酶活性,表明 microRNA-212 能夠直接靶向MAPK1的3'-UTR結(jié)合位點(diǎn)。在前列腺癌細(xì)胞DU145和PC3細(xì)胞中過表達(dá)microRNA-212 可顯著抑制 MAPK1 的 mRNA(P0.05)和蛋白(P0.05)的表達(dá),而下調(diào)microRNA-212可促進(jìn)MAPK1的mRNA(P0.05)和蛋白(P0.05)的表達(dá)。結(jié)果表明,在前列腺癌中MAPK1是microRNA-212的直接靶基因。4、前列腺癌組織中MAPK1的mRNA水平及蛋白表達(dá)均顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織。通過Spearman相關(guān)分析顯示,MAPK1的mRNA表達(dá)與microRNA-212的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在前列腺癌細(xì)胞DU145和PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染microRNA-212 mimics,同時(shí)轉(zhuǎn)染MAPK1過表達(dá)載體(pcDNA3.1-MAPK1)或空載體(pcDNA3.1)。發(fā)現(xiàn)microRNA-212過表達(dá)引起的MAPK1下調(diào)可以被同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MAPK1所抑制。MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)研究表明,上調(diào)的MAPK1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)microRNA-212對前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用和促凋亡作用。5、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)染microRNA-212 mimics的DU145細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤大小顯著小于對照組(P0.05),免疫組化染色提示轉(zhuǎn)染microRNA-212 mimics的裸鼠組Ki67表達(dá)水平顯著低于microRNA-NC組,Western blot實(shí)驗(yàn)提示轉(zhuǎn)染microRNA-212 mimics組裸鼠腫瘤中MAPK1的表達(dá)水平更低(P0.05)。結(jié)論:1.前列腺癌組織中microRNA-212表達(dá)顯著下降,microRNA-212的表達(dá)與Gleason評分、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),microRNA-212能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲并促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。2.在前列腺癌中MAPK1是microRNA-212的直接靶基因,microRNA-212通過調(diào)控MAPK1,抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲,促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。
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采用ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法，，檢測３４對前列腺癌組織和其對應(yīng)的癌旁組織中的逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２的表達(dá)。結(jié)果表明，和癌旁組織相比，前列腺癌腫瘤組織中的逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２表達(dá)顯著降低（Ｐ〈０．邋０５，圖１Ａ）。通過檢測４種前列腺癌細(xì)胞系逡逑（ＤＵ１４５、邋ＰＣ３、２２ＲＶ１和ＬＮＣａＰ）和人類正常前列腺上皮細(xì)胞（ＲＷＰＥ－１）中逡逑ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２的表達(dá)情況，結(jié)果顯示ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)逡逑顯著低于ＲＷＰＥ－１（Ｐ＜０．０５，圖１Ｂ）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ＤＵ１４５和ＰＣ３細(xì)胞系比２２ＲＶ１逡逑以及ＬＮＣａＰ細(xì)胞系表達(dá)ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２低（Ｐ＜０．邋０５），我們選擇ＤＵ１４５和ＰＣ３逡逑兩種細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。上述結(jié)果表明ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２可能和前列腺癌的發(fā)逡逑生進(jìn)展具有相關(guān)性。逡逑圖１Ａ逡逑０．５－１逡逑曰邐＊逡逑－０．４－邐？逡逑心邐Ｉ逡逑Ｋ邋ｏｓ－逡逑對。２－邐00逡逑嫌逡逑癌旁姐塑邐邋前列腺癌組織逡逑圖１Ａ：邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，可見相比癌旁組織，逡逑前列腺癌組織中的ｍｉｃｒｏＲＮＡ＿２１２表達(dá)顯著降低。＊Ｐ〈０．邋０５逡逑２４逡逑

ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染了邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２邋ｍｉｍｉｃｓ的ＤＵ１４５和ＰＣ３細(xì)胞，其增逡逑殖率降低，而轉(zhuǎn)染了邋ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ的ＤＵ１４５和ＰＣ３細(xì)胞增殖率上升逡逑（ｐ＜０．邋０５，圖２Ｂ）。同時(shí)，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２抑制逡逑了邋ＤＵ１４５和ＰＣ３細(xì)胞的遷移、侵襲，而下調(diào)ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２１２則X椙浚模眨保矗島停校茫沖義舷赴那ㄒ�、侵袭能力（ｐ�

本文編號：2613620