【摘要】：目的:在腫瘤微環(huán)境中,存在某些免疫負(fù)性調(diào)控分子,特別是PD-L1分子,不僅可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展,還參與了腫瘤免疫逃逸。MUC1作為一種跨膜糖蛋白在乳腺癌組織中高表達(dá),參與多種腫瘤的免疫反應(yīng)。近期的研究已證實(shí),NSCLC(非小細(xì)胞性肺癌)中,靶向MUC1后PD-L1分子的表達(dá)下調(diào)。本課題旨在針對乳腺癌中MUC1對PD-L1分子表達(dá)調(diào)控的研究,為后續(xù)研究PD-L1分子的表達(dá)調(diào)控奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:1、PD-L1及MUC1在乳腺組織的表達(dá)情況。從臨床收集14例乳腺癌患者的病理組織(乳腺癌組織及癌旁正常組織),將其作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本,并隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組。分別使用免疫組化方法染色,標(biāo)記PD-L1及MUC1分子,根據(jù)陽性分子體積占比進(jìn)行半定量計(jì)算,統(tǒng)計(jì)PD-L1及MUC1的表達(dá)情況以分析MUC1和PD-L1在乳腺癌標(biāo)本中的相關(guān)性。2、篩選PD-L1、MUC1陽性表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞株。通過Western Blot(WB)和流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測人乳腺癌細(xì)胞株(MX-1,SKBR3,MDA-MB231、MCF-7、HCC1937)中MUC1、PD-L1蛋白表達(dá)情況,篩選出PD-L1和MUC1均表達(dá)的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3、過表達(dá)MUC1重組載體及靶向MUC1重組慢病毒載體的構(gòu)建。PCR擴(kuò)增出MUC1-mRNA序列同pEX-1載體相連接,構(gòu)建pEX-1-MUC1的重組質(zhì)粒;針對MUC1-mRNA序列設(shè)計(jì)shRNA引物,進(jìn)一步退火,連接,慢病毒包被,構(gòu)建靶向MUC1的shRNA-MUC1重組慢病毒。4、體外初步驗(yàn)證MUC1對PD-L1的表達(dá)調(diào)控。對構(gòu)建完成后的pEX-1-MUC1重組質(zhì)粒及shRNA-MUC1重組慢病毒分別轉(zhuǎn)染及侵襲上述篩選出的乳腺癌細(xì)胞株,利用q-PCR(Real Time quantitative PCR,RT-qPCR)、WB及流式細(xì)胞技術(shù)檢測MUC1不同處理后,PD-L1的表達(dá)情況。5、MUC1對乳腺癌細(xì)胞PD-L1調(diào)控機(jī)制的初步探討。將PD-L1啟動(dòng)子區(qū)目的DNA序列同熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic連接,構(gòu)建人PD-L1啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),再分別轉(zhuǎn)染處理前后的乳腺癌細(xì)胞,利用雙熒光素酶活性報(bào)告系統(tǒng)原理檢測啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱;用NF-kB-p65通路抑制劑BAY-8075處理細(xì)胞后,比較處理前后細(xì)胞啟動(dòng)子活性強(qiáng)弱。結(jié)果:1、臨床乳腺癌標(biāo)本的組化顯示MUC1和PD-L1的表達(dá)存在正相關(guān)性;2、成功篩選出PD-L1及MUC1陽性的人乳腺癌細(xì)胞株(MD-MBA231,MX-1,SKBR3);3、成功構(gòu)建了MUC1過表達(dá)重組載體(pEX-1-MUC1)及靶向MUC1的慢病毒載體(shRNA-MUC1);4、qPCR和WB結(jié)果均顯示,乳腺細(xì)胞株MB231在過表達(dá)MUC1后,相應(yīng)的PD-L1其mRNA、蛋白水平均較對照組表達(dá)量上調(diào);三株乳腺癌細(xì)胞株(MB231,MX-1,SKBR3)在靶向MUC1處理后,PD-L1表達(dá)量下調(diào);5、雙熒光素酶活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,乳腺細(xì)胞株MB231在過表達(dá)MUC1后,相應(yīng)的PD-L1啟動(dòng)子活性較對照組升高;三株乳腺癌細(xì)胞株(MB231,MX-1,SKBR3)在靶向MUC1處理后,PD-L1啟動(dòng)子活性與對照組相比均不同程度降低;三組乳腺癌細(xì)胞在BAY作用后其啟動(dòng)子活性均低于未處理組。結(jié)論:在人乳腺癌細(xì)胞中,MUC1可正向調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá),并且可能通過NF-k B通路來影響PD-L1啟動(dòng)子活性從而起到對PD-L1的表達(dá)調(diào)控作用。
【圖文】：

Biogps網(wǎng)站分析MUC1及PD-L1在人體組織中基因的表達(dá)情況

圖 1.2 GEPIA 網(wǎng)站分析 MUC1 和 PD-L1 在人乳腺組織中蛋白的表達(dá)情況Figure1.2 The expression of MUC1and PD-L1 in human mammary tissue analyzed throughGEPIA1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測乳腺癌中 MUC1 及 PD-L1 在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)免疫組織化學(xué)法對乳腺癌細(xì)胞膜表面進(jìn)行抗體染色后，通過對抗體著色部分進(jìn)行面積評定，根據(jù)染色面積占比情況區(qū)分陽性和陰性。結(jié)果顯示，經(jīng) MUC單抗處理過的乳腺癌組織染色清晰，著色以細(xì)胞膜處為主，呈深棕色，陽性細(xì)胞數(shù)目極多，，分布比較集中；經(jīng) PD-L1 單抗處理過的乳腺癌組織著色以細(xì)胞膜處為主，呈棕色，分布相對彌散，如圖 1.3 所示，實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表 1.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 李霓;鄭榮壽;張思維;鄒小農(nóng);曾紅梅;代珍;陳萬青;;中國城鄉(xiāng)女性乳腺癌發(fā)病趨勢分析和預(yù)測[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2012年08期

2 Yaron Niv;;Microsatellite instability and MLH1 promoter hypermethylation in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2007年12期

本文編號：2613535