腫瘤細(xì)胞中DIRAS3調(diào)控RAC1的分子機(jī)制

發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 17:28

【摘要】：據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),腫瘤是繼心腦血管疾病后導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病。其中,90%以上的腫瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的精細(xì)分子機(jī)制對于腫瘤的臨床治療具有重要意義。惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位,經(jīng)淋巴道、血管或體腔等途徑,到達(dá)其他部位繼續(xù)生長,造成組織的局部侵蝕,損傷系統(tǒng)功能,引發(fā)劇烈疼痛甚至威脅生命。DIRAS3是小G蛋白Ras亞家族的成員,是該家族中被報(bào)道的第一個(gè)腫瘤抑制蛋白,在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程中起著關(guān)鍵的作用。它能抑制卵巢癌細(xì)胞中FAK介導(dǎo)的RHOA信號通路,降低RHOA-GTP水平,減少應(yīng)力纖維的形成,從而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。RAC1與RHOA同屬小G蛋白Rho亞家族,主要受其激活蛋白GEFs和抑制蛋白GAP、GDI的調(diào)控,在RAC1-GTP活化形式和RAC1-GDP失活形式之間轉(zhuǎn)換,調(diào)控下游效應(yīng)蛋白激酶PAK及一些肌動(dòng)蛋白調(diào)控蛋白的活性,影響細(xì)胞膜骨架重排和細(xì)胞片狀偽足的形成,在腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲過程中起著極其重要的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn),DIRAS3能調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中RAC1的表達(dá),對細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化有重要的調(diào)控作用。因此,本文主要就DIRAS3對RAC1的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。首先,我們在Calu-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DIRAS3的質(zhì)粒,進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DIRAS3的過表達(dá)抑制Calu-1細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),同時(shí),F-actin染色結(jié)果顯示,DIRAS3的高表達(dá)抑制了細(xì)胞片狀偽足的形成,免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),DIRAS3的過表達(dá)導(dǎo)致調(diào)控細(xì)胞片狀偽足的關(guān)鍵蛋白RAC1表達(dá)水平降低,即DIRAS3可能通過調(diào)控RAC1的表達(dá)影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。于是,我們探究了 DIRAS3對RAC1蛋白水平的影響。我們在Calu-1和H1792中轉(zhuǎn)染了 DIRAS3質(zhì)粒,并用蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體抑制劑E64D處理,免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DIRAS3影響RAC1蛋白酶體途徑的降解。隨后在293FT細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染DIRAS3及RAC1的質(zhì)粒,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DIRAS3和RAC1存在相互作用,且進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,DIRAS3促進(jìn)RAC1的多聚泛素化。接下來,我們運(yùn)用siRNA干擾技術(shù),western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)和蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)找到可能調(diào)控RAC1降解的E3連接酶RNF19B。RNF19B又名NKLAM,是RBR E3連接酶家族成員,屬于跨膜蛋白。RNF19B在很多方面表現(xiàn)出抑癌基因的功能。研究表明,RNF19B能控制體內(nèi)腫瘤發(fā)展,特別是在抑制腫瘤向遠(yuǎn)處的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用,但是其作用機(jī)制尚不明確。我們根據(jù)結(jié)構(gòu)域分析對RNF19B進(jìn)行了分段克隆,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RAC1與RNF19B的三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域均可結(jié)合,但與其RING2結(jié)構(gòu)域結(jié)合最為明顯。同時(shí),我們在293FT細(xì)胞的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RNF19B和DIRAS3能夠結(jié)合,即DIRAS3可能會(huì)促進(jìn)RNF19B和RAC1的結(jié)合。綜上所述,我們以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究模型,研究了 DIRAS3調(diào)控RAC1的分子機(jī)制,提出DIRAS3可能通過促進(jìn)E3連接酶RNF19B與RAC1的結(jié)合,促進(jìn)RAC1的泛素化降解,從而抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。
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