【摘要】：研究背景和目的:腎細(xì)胞癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,約占成人惡性腫瘤的2-3%,近幾年其發(fā)病率還在逐年升高,死亡率達(dá)到40%左右~([1,2])。當(dāng)前能夠治愈腎細(xì)胞癌的方法只有行根治性手術(shù)~([3-5]),但是很多患者就診時(shí)已經(jīng)為晚期,不能行手術(shù)治療。即使對(duì)于早期患者,根治性手術(shù)切除后約25%仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn);而傳統(tǒng)的放化療對(duì)腎癌效果不佳~([6]),因此使得晚期腎癌患者沒有很好的治療方法,預(yù)后較差。腎癌的分子標(biāo)記物相比于其它腫瘤較少~([7])。因此研究腎癌轉(zhuǎn)移侵襲的發(fā)生機(jī)制,發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)及治療手段迫在眉睫。CSN是一種多亞基蛋白復(fù)合體,通過調(diào)控泛素蛋白酶體的降解過程而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,CSN5是CSN第5個(gè)亞單位,又是其活化中心~([8,9])。CSN5參與了各種細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控,如細(xì)胞的增殖及凋亡~([10,11])。許多證據(jù)表明CSN5與人體多種惡性腫瘤相關(guān)~([12,13])。阻斷CSN5可以達(dá)到抗腫瘤治療的效果~([14])。而在多種惡性腫瘤~([15-17])中,CSN5表達(dá)水平越高,則預(yù)后會(huì)更差。然而腎癌中CSN5的表達(dá)形式及生物學(xué)行為目前尚不清楚。EMT是上皮細(xì)胞到間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲關(guān)系密切,是惡性腫瘤獲得浸潤(rùn)能力的重要方式,在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)~([35,36])。ZEB1是EMT過程中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子,ZEB1引起的EMT參與了多種腫瘤的過程~([42-44])。ZEB1是通過泛素化系統(tǒng)降解的~([50]),有研究報(bào)道有泛素化連接酶會(huì)驅(qū)動(dòng)腎細(xì)胞癌的EMT,并通過上調(diào)ZEB1表達(dá)來增加腎細(xì)胞癌的侵襲能力~([46])。CSN5是通過對(duì)泛素化連接酶進(jìn)行脫泛素化參與腫瘤的發(fā)展~([61,62]),因此我們推測(cè)CSN5是否也是通過ZEB1介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲及EMT的。為了證明我們的推測(cè),首先我們檢測(cè)了所收集臨床腎癌患者標(biāo)本組織中CSN5的表達(dá)水平,分析CSN5的表達(dá)與腎癌患者的臨床特點(diǎn)及生存率的關(guān)系;其次通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討CSN5與ZEB1的關(guān)系及其對(duì)腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力及EMT的影響;最后研究CSN5調(diào)控ZEB1的具體機(jī)制。方法:1、應(yīng)用qRT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)手術(shù)切除后的腎癌組織、相對(duì)應(yīng)癌旁組織中CSN5 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,收集患者的臨床病理特征資料,統(tǒng)計(jì)CSN5的表達(dá)與患者的臨床病理特征、生存率之間的關(guān)系;2、將ACHN、786-O、A498和caki-1四種腎癌細(xì)胞株和正常人腎細(xì)胞株HK中CSN5的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shCSN5到ACHN腎癌細(xì)胞中,運(yùn)用Western blot及qRT-PCR檢測(cè)腎癌細(xì)胞中CSN5蛋白和mRNA的表達(dá)變化;降低腎癌細(xì)胞中CSN5的表達(dá),應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的變化;比較轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染shCSN5的腎癌細(xì)胞株的裸鼠皮下腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率;3、用Western-blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)比較在腎癌細(xì)胞中沉默CSN5后EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的變化;用熒光定量PCR和Western-blot檢測(cè)使CSN5表達(dá)升高或降低后ZEB1的表達(dá)變化;用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默CSN5后的腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZEB1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移侵襲能力;Western-blot檢測(cè)所收集的40例腎癌組織及癌旁組織中CSN5與ZEB1的相關(guān)性;4、利用免疫共沉淀及免疫熒光方法證實(shí)CSN5是直接作用于ZEB1,western blot及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明CSN5調(diào)控ZEB1的表達(dá)是通過泛素化系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的。結(jié)果:1、qRT-PCR和Western blot顯示40例樣本中腎癌組織中CSN5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于癌旁正常組織(p0.05);免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示80例患者中,腎癌組織中有45例CSN5為高表達(dá),陽性率為56.3%,癌旁組織有21例高表達(dá),陽性率為26.3%;而且CSN5的陽性表達(dá)差異與腫瘤的T分期、腫瘤的大小有關(guān);CSN5的陽性表達(dá)與腎癌患者生存率呈負(fù)相關(guān)。2、將shCSN5轉(zhuǎn)染到腎癌ACHN細(xì)胞中,qRT-PCR和western blot顯示沉默CSN5后其mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(p0.05);Transwell實(shí)驗(yàn)顯示沉默CSN5的腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力降低;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shCSN5組較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組,y|鼠皮下形成的腫瘤更小(p0.05),肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率更低。3、用Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CSN5高表達(dá)后波形蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)升高,而E-鈣粘蛋白表達(dá)下降;CSN5高表達(dá)后ZEB1表達(dá)也增加,相反CSN5表達(dá)下降后ZEB1表達(dá)也下降;而ZEB1 mRNA水平并不會(huì)受CSN5調(diào)節(jié)異常而變化。沉默CSN5后顯著降低了ACHN細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力,而由CSN5沉默引起的轉(zhuǎn)移和侵襲能力的下降,可以通過上調(diào)ZEB1來增加。4、免疫共沉淀和免疫熒光證實(shí)在腎癌細(xì)胞中內(nèi)源性CSN5與ZEB1是結(jié)合在一起的,免疫共沉淀和Western blot結(jié)果證實(shí)CSN5穩(wěn)定ZEB1蛋白水平是通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論:CSN5在腎癌中表達(dá)升高,能調(diào)控腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力及EMT,它的機(jī)制是通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)穩(wěn)定ZEB1蛋白水平。
【圖文】：

5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤(X 土 SEM)表示，計(jì)數(shù)資料以百分比或示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 t 檢驗(yàn)、ANOVE 以及 Fisher 檢驗(yàn)方法，使用 SPSS1計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，若 P<0.05 則為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 為差異著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié) 果1．檢測(cè) CSN5 在腎癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(1)從所采集的腎癌組織及癌旁組織標(biāo)本中隨機(jī)選取 40 例，應(yīng)用 qRT-P測(cè) CSN5 mRNA 的表達(dá)情況。qRT-PCR 結(jié)果顯示 CSN5 mRNA 的表達(dá)在腎織中明顯高于癌旁正常組織（p<0.01）。如圖 1.1

n-Meier 曲線繪制腎癌組織中 CSN5 的低表達(dá)和高表p＜0.01。討 論種多亞基蛋白復(fù)合體，CSN5是CSN的第5個(gè)被人認(rèn)知[8,9]。CSN 具有識(shí)別泛素化底物的作量的研究顯示 CSN5 能夠通過泛素化參與調(diào)從而參與了各種細(xì)胞的增殖與凋亡過程[10,11]，素化系統(tǒng)降解的，近來也有越來越多的研究證生進(jìn)展過程[15-17]。例如，阻斷 CSN5 的表達(dá)，SN5 高表達(dá)往往伴隨著不良愈后[16]，文獻(xiàn)報(bào)的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。那么，CSN5 是否也 CSN5 在腎癌中的表達(dá)情況以及其與患者臨
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.11

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本文編號(hào)：2606503