【摘要】：研究背景和意義:結(jié)直腸癌(CRC)仍然是一個(gè)重要的全球性健康問題,2008年在全球范圍內(nèi)有120多萬新發(fā)結(jié)直腸癌病例和60多萬與其相關(guān)的死亡病例。近年來,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,我國CRC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,且CRC發(fā)病比較隱匿,往往在發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤己處于進(jìn)展期甚至晚期階段,這就給臨床治療帶來許多的困難,不利于改善患者的預(yù)后。到目前為止,由于手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步以及放療、化療和靶向治療的結(jié)合,CRC患者的預(yù)后有了顯著的改善。然而,對于晚期CRC患者和局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者,預(yù)后仍然很差。因此,科學(xué)家一直致力于探索CRC的病因并提高其臨床療效的研究,期望能夠改善CRC患者的生存率。目前研究表明,CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程,它涉及多種因素、多個(gè)階段以及多個(gè)基因的改變和協(xié)同作用,其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是CRC發(fā)生與發(fā)展的重要特征。目前研究已經(jīng)顯示,CRC的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程涉及到多個(gè)相關(guān)基因的改變,但其機(jī)制復(fù)雜,尚未完全明了。因此,有必要研究CRC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和關(guān)鍵調(diào)控因子,從而為預(yù)測腫瘤發(fā)生、局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供相應(yīng)的生物標(biāo)志物,這樣我們才能更好地選擇治療策略,最終改善患者的預(yù)后。DNA甲基化通過抑制某些抑癌基因的表達(dá)來影響腫瘤的進(jìn)程,而DNA去甲基化則可以激活某些癌基因或抑癌基因的表達(dá)。DNA羥甲基化是一種主動(dòng)去甲基化的修飾過程,TET(Ten eleven translocation)是加雙氧酶家族的成員,是DNA羥甲基化的調(diào)控酶,能將5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥基甲基胞嘧啶(5-hmC),并導(dǎo)致CpG島的去甲基化。TET蛋白的缺失或突變以及與其伴隨的5-hmC含量的下調(diào)在各種人類癌癥中都很常見。研究發(fā)現(xiàn),TET1在乳腺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌中通常不存在。此外,有報(bào)道稱,在結(jié)腸癌的起始階段,TET1在癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),從而導(dǎo)致WNT通路抑制劑的啟動(dòng)子被抑制,其結(jié)果是導(dǎo)致了WNT通路的本構(gòu)激活。然而,導(dǎo)致這一重要的腫瘤抑制因子在CRC下調(diào)的機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。MicroRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA,廣泛存在于生物基因組中。它能與目標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)域(3'-UTRs)進(jìn)行配對并結(jié)合,不完全降解mRNA或抑制mRNA的翻譯,參與調(diào)控了一半以上的基因表達(dá)。此外,miRNA是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、組織發(fā)育、腫瘤發(fā)生等生理過程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。鑒于之前的研究表明TET1參與抑制CRC細(xì)胞的生長,我們假設(shè)TET1在轉(zhuǎn)錄后水平上受miRNA調(diào)控。在我們的研究中,我們發(fā)現(xiàn)與CRC患者的癌旁鄰近組織樣本相比,CRC患者的癌組織樣本中miR-21的表達(dá)上調(diào),而TET1的表達(dá)明顯下降。此外,我們的研究結(jié)果表明,miR-21通過靶向作用于TET1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移。第一部分結(jié)直腸癌組織中miR-21和TET1的表達(dá)情況及二者相關(guān)性研究目的研究結(jié)直腸癌組織中miR-21和TET1的表達(dá)情況及相互關(guān)聯(lián)方法采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測miR-21可靶向作用于TET1。收集2016-2017年間在山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院胃腸外科由同一手術(shù)團(tuán)隊(duì)確診并行根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌患者50例。取其腫瘤組織細(xì)胞及對應(yīng)的切緣腫瘤檢測陰性的正常結(jié)直腸組織細(xì)胞,采用新鮮冰凍樣本進(jìn)行miR-21和TET1表達(dá)分析。使用qRT-PCR分析50對臨床CRC和鄰近的非癌組織中miR-21和TET1 mRNA的表達(dá)情況,并通過內(nèi)源性對照對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理,分析二者表達(dá)差異,并進(jìn)一步評估了 miR-21和TET1表達(dá)之間的相關(guān)性。結(jié)果目前用于預(yù)測miRNA靶基因的網(wǎng)站軟件有很多,如miRBase、TargetScan和starbase等,我們選擇在線應(yīng)用多個(gè)生物信息學(xué)預(yù)測軟件對miR-21的靶基因進(jìn)行預(yù)測,將3各數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果取交集,預(yù)測得出miR-21可信度和準(zhǔn)確性較高的靶基因。結(jié)合既往的研究結(jié)果,選擇其中最有可能并且與腫瘤有一定關(guān)系的一個(gè)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。我們篩選出的靶基因?yàn)門ET1。然后,我們使用qRT-PCR分析50對臨床CRC和鄰近的非癌組織中TET1 mRNA的表達(dá),并參照內(nèi)源性對照(GAPDH)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理。結(jié)果顯示,與相應(yīng)的鄰近組織相比,50例CRC患者的腫瘤組織中TET1 mRNA的表達(dá)水平較低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。我們同樣檢測了 miR-21的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)CRC患者的腫瘤組織中miR-21的表達(dá)水平較對應(yīng)的鄰近組織高,差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。然后我們評估了 miR-21和TET1 mRNA相對表達(dá)水平之間的相關(guān)性。不出所料,我們發(fā)現(xiàn)在CRC組織中miR-21水平與TET1 mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.409,P=0.0032)�？偟膩碚f,我們的發(fā)現(xiàn)表明,與相應(yīng)的鄰近組織相比,50例CRC患者的腫瘤組織中TET1 mRNA表達(dá)水平較低,而miR-21的表達(dá)水平較高。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)miR-21水平與TET1mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論與相應(yīng)的鄰近組織相比,結(jié)直腸癌組織中miR-21高表達(dá)而TET1 mRNA低表達(dá),且二者表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。第二部分體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TET1是miR-21的靶基因及其調(diào)控關(guān)系研究目的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21可靶向作用于TET1 mRNA的3'-UTRs,抑制CRC細(xì)胞中TET1的表達(dá)。方法將預(yù)測與miR-21相互作用的TET1 mRNA的3'-UTRs序列或與預(yù)測目標(biāo)位點(diǎn)相互作用的突變序列插入pmirGLO載體中(Promega,USA)。它們分別被命名為 pmirGLO-TET1-wt 和 pmirGLO-TET1-mut。向結(jié)直腸癌細(xì)胞株 HCT15 和 HT29共轉(zhuǎn)染 hsa-miR-21 mimics(miR-21)/NC(miR-control)和 pmirGLO-TET1-wt/pmirGLO-TET1-mut,使用熒光素酶檢測設(shè)備檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光素酶活性,根據(jù)檢測結(jié)果判斷miR-21與TET1 mRNA的3'-UTRs是否相結(jié)合。為了進(jìn)一步研究miR-21對TET1表達(dá)的影響,我們在HCT15和HT29細(xì)胞中進(jìn)行了 miR-21和抗miR-21的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,使用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染后miR-21和TET1 mRNA的表達(dá)情況。同時(shí),我們使用蛋白印跡的方法檢測轉(zhuǎn)染后TET1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果熒光素酶報(bào)告基因分析顯示,在HCT15細(xì)胞中miR-21與pmirGLO-TET1-wt 反應(yīng)組較其余三組(miR-21 與 pmirGLO-TET1-mut 組、miR-contro1 與 pmirGLO-TET1-wt 組、miR-control 與 pmirGLO-TET1-mut 組)的螢火蟲熒光素酶活性明顯偏低(P0.05),而其余三組無明顯差異。在HT29細(xì)胞中也產(chǎn)生了同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明miR-21以劑量依賴性的方式顯著抑制pmirGLO-TET1-wt的螢火蟲熒光素酶活性,而當(dāng)靶位點(diǎn)在HCT15和HT29細(xì)胞中發(fā)生突變時(shí),miR-21則不能發(fā)揮作用,這就證實(shí)了 miR-21可靶向作用于TET1mRNA的3'-UTRs。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示,與對照組HCT15和HT29細(xì)胞中的miR-21相比,實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染miR-21后引起miR-21表達(dá)上調(diào),并導(dǎo)致TET1 mRNA水平明顯降低,而轉(zhuǎn)染抗miR-21后引起miR-21表達(dá)下調(diào),并導(dǎo)致TET1 mRNA水平明顯升高。當(dāng)CRC細(xì)胞中miR-21的表達(dá)升高時(shí),TET1蛋白水平顯著降低,而抑制兩種CRC細(xì)胞中miR-21的表達(dá)時(shí),TET1蛋白水平顯著升高�？偟膩碚f,我們的實(shí)驗(yàn)表明,在CRC細(xì)胞中miR-21可靶向作用于TET1 mRNA的3'-UTRs并引起TET1的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論TET1是CRC細(xì)胞中miR-21的一個(gè)靶基因,miR-21能夠引起CRC細(xì)胞中TET1的表達(dá)下調(diào)。第三部分MiR-21調(diào)控TET1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目的探討miR-21調(diào)控TET1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力的影響方法根據(jù)之前研究結(jié)果,miR-21能夠下調(diào)CRC細(xì)胞中的TET1表達(dá)。而最近的研究發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,在結(jié)直腸腫瘤組織中,TET1表達(dá)顯著減少,癌細(xì)胞的擴(kuò)散與TET1的沉默有關(guān)。因此,我們進(jìn)一步研究miR-21調(diào)控TET1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。我們通過向CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)染抗miR-21,降低miR-21的表達(dá)而抬高TET1表達(dá),然后再轉(zhuǎn)染si-TET1從而敲低TET1的表達(dá),研究細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的變化。本實(shí)驗(yàn)在兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT15和HT29中轉(zhuǎn)染抗miR-21、抗miR-21+ si-TET1及相應(yīng)對照,使用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后各組miR-21和TET1 mRNA表達(dá)水平,使用Western blot檢測TET1蛋白表達(dá)水平。然后選用EdU檢測和CCK-8分析驗(yàn)證miR-21調(diào)控TET1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力的影響,選用Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-21調(diào)控TET1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力的影響,選用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-21調(diào)控TET1表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)果在兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT15和HT29中轉(zhuǎn)染抗miR-21、抗miR-21+si-TET1及相關(guān)對照后使用qRT-PCR、Western blot檢測各組miR-21和TET1表達(dá)水平及TET1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示在兩組CRC細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染抗miR-21組細(xì)胞較對照組miR-21表達(dá)下調(diào),TET1 mRNA水平明顯升高,TET1蛋白表達(dá)水平升高;轉(zhuǎn)染抗miR-21+si-TET1組細(xì)胞較對照組miR-21表達(dá)下調(diào),TET1 mRNA和TET1蛋白表達(dá)水平均無明顯差異,而較抗miR-21組細(xì)胞TET1 mRNA和TET1蛋白表達(dá)水平均明顯降低。實(shí)驗(yàn)表明抗miR-21轉(zhuǎn)染后降低了 miR-21的表達(dá),上調(diào)了 TET1的表達(dá);而同時(shí)轉(zhuǎn)染抗miR-21+si-TET1后降低了 miR-21的表達(dá),但TET1的表達(dá)無明顯上調(diào)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染達(dá)到了預(yù)期效果后,我們進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。EdU檢測顯示,抗miR-21組細(xì)胞較對照組及抗miR-21+ si-TET1組細(xì)胞增殖明顯降低(P0.05),而抗miR-21+si-TET1組細(xì)胞與對照組細(xì)胞增殖能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CCK-8分析表明,在HCT15和HT29細(xì)胞中使用抗miR-21處理后,CRC細(xì)胞的增殖能力較對照組顯著降低,而對照組和用抗miR-21+si-TET1同時(shí)處理組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Transwell實(shí)驗(yàn)表明,抗miR-21處理后細(xì)胞侵襲能力較對照組顯著降低,而對照組和用抗miR-21+si-TET1同時(shí)處理組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明,抗miR-21處理后細(xì)胞遷移能力較對照組顯著降低,而對照組或用抗miR-21+si-TET1同時(shí)處理組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT15和HT29中,抗miR-21處理后TET1高表達(dá)使得細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力均降低,但通過同時(shí)與抗miR-21和si-TET1作用使得TET1低表達(dá),可以抵消抗miR-21介導(dǎo)的HCT15和HT29細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-21影響細(xì)胞增殖、侵襲和遷移部分依賴于TET1的作用。結(jié)論miR-21可以通過靶向作用于CRC細(xì)胞中的TET1來促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑多３，ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ＞１０，ｐｒｏｇｒａｍＮｕｍ多５，ＣｌｅａｖｅＥｘｐＮｕｍ多邋１。我們篩選出的革巴基逡逑因有：ＰＣＢＰ２，ＧＩＤ４，，邋ＭＴＭＲ１２，邋ＮＦＩＢ，ＰＩＫ３Ｒ１，ＴＥＴ１。同時(shí)我們將邋３邋個(gè)數(shù)逡逑據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行匯總并取交集，得到較真實(shí)和穩(wěn)定的靶基因。結(jié)合既往的研逡逑究結(jié)果，選擇其中最有可能并且與ＣＲＣ有一定關(guān)系的一個(gè)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。我逡逑們篩選出的靶基因?yàn)椋裕牛裕薄ｅ义希恚椋遥危铃澹牵澹睿澹危铮恚邋澹校桑裕铃澹遥危粒玻插澹恚椋遥恚幔恚椋悖颍铮藻澹恚椋遥幔睿洌徨澹校椋悖裕铮蝈澹裕幔颍澹簦樱悖幔铄澹粒铮牛危酰礤澹茫桑悖幔觯悖牛穑危酰睿╁澹校幔睿茫幔睿悖澹蝈义?

圖２：邋ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ預(yù)測ＴＥＴ１與ｍｉＲ－２１的結(jié)合位點(diǎn)逡逑２．邐５０對臨床ＣＲＣ和鄰近的非癌組織中ＴＥＴ１邋ｍＲＮＡ的表達(dá)情況逡逑我們使用ｑＲＴ－ＰＣＲ分析５０對臨床ＣＲＣ和鄰近的非癌組織中ＴＥＴ１邋ｍＲＮＡ逡逑的表達(dá)，并參照內(nèi)源性對照（ＧＡＰＤＨ）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)歸一化處理。結(jié)果顯示，與相應(yīng)逡逑的鄰近組織相比，５０例ＣＲＣ患者的腫瘤組織中ＴＥＴ１邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平較低，逡逑差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＜0．0５）。逡逑＾邋＊逡逑，１０１邐＇邐Ｎ＝５０＿逡逑ｉ0．８－邋ｐＥＥｑ逡逑§邋０．６－逡逑卜邐丁逡逑￡邋０．２－邐■逡逑Ｉ邋０．０Ｊ邐１邐．邐逡逑ｉ邐Ｐａｒａｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邐Ｔｕｍｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 范敏;TET1在腎癌中表達(dá)及其抑制腫瘤的作用機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

本文編號：2606400