【摘要】：調節(jié)性T細胞(Regulatory Tcells,Tregs)自從被發(fā)現(xiàn)以來,已經(jīng)成為人們的研究熱點。Tregs在自身免疫疾病和炎癥中發(fā)揮重要的作用。同時,Tregs在腫瘤生長和轉移中也扮演了重要的角色。近幾年,針對Tregs的免疫檢查點抑制劑在非小細胞肺癌,黑色素瘤和結直腸癌等癌癥的治療中起到積極作用。研究Tregs分化早期表達譜的變化可以幫助我們更好的理解Tregs。使用RNA測序(RNA-Seq)進行表達譜分析是一種研究生物學動態(tài)過程變化的強大的技術。本次研究,我們利用RNA-Seq技術探索Tregs分化過程表達譜的變化情況。通過差異分析分析,我們找到了 Tregs在5h,12h和48h的差異顯著基因,同時也找到了這些基因參與的生物學過程,比如Jak-STAT信號通路,TNF信號通路和PI3K-Akt等信號通路。在癌癥早期,免疫細胞有殺死癌細胞的作用。但是在癌癥晚期,由于大量存在的免疫抑制細胞,如腫瘤相關巨噬細胞,Tregs和髓源移植性細胞等,抑制了腫瘤殺傷性T細胞的活性。進而促進腫瘤免疫逃逸,生長和轉移。了解腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的亞型,以及腫瘤細胞通過何種機制調節(jié)周圍的免疫細胞表達,對我們治療癌癥有重要的意義。最近幾年,單細胞RNA測序技術(scRNA-seq)迅猛發(fā)展,并即將取代大批量RNA-Seq(bulk RNA-seq)。通過分析單細胞水平上的轉錄組,scRNA-seq為復雜的生物系統(tǒng)提供了新的見解,并賦予生物體內每個細胞一個獨特的身份。這使得我們能夠解決在過去幾年中一直被回避的科學問題,比如腫瘤的異質性。于是我們先建立了 scRNA-seq數(shù)據(jù)分析流程,用其分析黑色素瘤單細數(shù)據(jù),最終得到了和原文相似的結果。同時我們又建立了混合線性模型,找到了腫瘤細胞調控Tregs,B細胞以及CD8+T細胞表達的基因,并探討了這些基因參與的生物學過程。其中和Tregs顯著關聯(lián)的基因主要參與一氧化氮代謝過程,和B細胞顯著關聯(lián)的基因主要參與INF-I信號通路,和CD8+ T細胞顯著關聯(lián)的基因主要參與調節(jié)對刺激反應的生物過程。
【圖文】：

富集分析是采用超幾何分布的方式，將基因富集在己有的通路中，探討這些逡逑基因的功能。目前已經(jīng)有許多工具可以做富集分析，比如Ｇｅｎｅ邋Ｓｅｔ邋Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ逡逑Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）［ｌｕ］，ＤＡＶＩＤ［ｍ＿邋ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ〖１１３］等等。ＧＳＥＡ邋只針對人的基因，逡逑不能選擇其它物種做。ＤＡＶＩＤ雖然可以選擇多個物種，但是它和ＧＳＥＡ邋—樣，逡逑更新的速度過慢，就導致了很多新發(fā)現(xiàn)的通路不能被富集出。本次實驗使用逡逑ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ做富集分析，它既可以選擇多物種注釋，同時包的更新速度很快，逡逑具有注釋最新的優(yōu)點。做ＧＯ分析的時候，只關注生物學過程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｐｒｏｃｅｓｓ），逡逑使用０．０５的ｑｖａｌｕｅ值作為顯著性水平。對于ＫＥＧＧ分析，使用０．１的ｑｖａｌｕｅ值逡逑作為顯著性水平。逡逑

對到基因組；５）用ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ軟件將ｒｅａｄｓ比對到基因上；６）使用ＵＭＩ－ｔｏｄｓ逡逑生成每個細胞的每個基因的表達矩陣，并將引物信息和ｐｌａｔｅ邋ｂａｒｃｏｄｅ信息加入逡逑表達矩陣的列名中。ＭＡＲＳ－Ｓｅｑ數(shù)據(jù)分析的流程如圖２。逡逑＾３Ｓｉｉ３Ｓ３逡逑？邋Ｒｅｍｏｖｅ邐？邋Ｆｉｎｄ邋ｃｅｌｌ邐？邋Ｓｐｌｉｔ邋ｆａｓｔｑ邐？邋Ａｌｉｇｎ邋ｒｅａｄｓ邐？邋Ｃｏｕｎｔ逡逑ｆｉｒｓｔ邋３ｂｐ邐ｂａｒｃｏｄｅ邐ｆｉｌｅｓ邐ｔｏ邋ｇｅｎｏｍｅ邐ｕｎｉｑｕｅ邋ｒｅａｄｓ逡逑？邋Ｅｘｔｒａｃｔ邋ＣＢ邐ｐｅｒ邋ｇｅｎｅｓ逡逑ａｎｄ邋ＵＭＩ邐！邐ｐｅｒ邋ｃｅｌｌ逡逑ｌ邋ｊ邋１邐＿Ｊ邐１邋ｊ邋１邐１邐［邐？逡逑圖２邋ＭＡＲＳ－Ｓｅｑ測序數(shù)據(jù)預處理逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｏｆ邋ＭＡＲＳ－Ｓｅｑ邋ｆａｓｔｑ邋ｆｉｌｅｓ逡逑２．３．２得到表達矩陣之后的處理逡逑２．３．２．１邋質控逡逑得到表達矩陣之后，首先要對數(shù)據(jù)做質控，即評估數(shù)據(jù)質量同時去除技術誤逡逑差。可以從以下三個方面考慮：１）統(tǒng)計每個細胞表達基因數(shù)目，，將表達量比較逡逑低的細胞去除；２）去除表達量比較極端的樣本：３）篩選有高度生物學變異的基逡逑因，具體的方法如前言所述。逡逑２．３．２．２數(shù)據(jù)標準化逡逑在數(shù)據(jù)標準化之前
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.3

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本文編號：2601919