【摘要】：研究背景和目的即使在氧氣供應(yīng)充足的情況下,腫瘤細(xì)胞仍優(yōu)先選擇糖酵解來提供能量,這一腫瘤細(xì)胞代謝特征被稱為“瓦爾伯格(Warburg)效應(yīng)”。糖酵解過程只產(chǎn)生少量的ATP,但可以積累大量的代謝中間產(chǎn)物從而為細(xì)胞增殖提供必需的原材料(如核苷酸,氨基酸,脂類)。丙酮酸激酶是糖酵解過程中重要的限速酶之一,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)轉(zhuǎn)變成丙酮酸和三磷酸腺苷(ATP)。真核細(xì)胞中存在四種丙酮酸激酶剪切異構(gòu)體,分別是L型丙酮酸激酶(PKL)、R型丙酮酸激酶(PKR)、M1型丙酮酸激酶(PKM1)和M2型丙酮酸激酶(PKM2),分別在人體不同的組織細(xì)胞中特異性表達(dá)。PKL在肝細(xì)胞中表達(dá),PKR在紅細(xì)胞中表達(dá)。PKM1和PKM2來源于同一前體mRNA,但是經(jīng)歷了不同的剪切過程。PKM1主要表達(dá)于人體正常組織,而PKM2僅在腫瘤組織和胚胎組織中表達(dá)。作為糖酵解過程的一個(gè)關(guān)鍵限速酶,PKM2對腫瘤細(xì)胞瓦爾伯格效應(yīng)的調(diào)控發(fā)揮非常重要的作用,然而調(diào)控PKM2的分子機(jī)制鮮有報(bào)道。翻譯后修飾是一種重要的蛋白質(zhì)功能調(diào)控機(jī)制,已有關(guān)于PKM2磷酸化、乙�；⒓谆刃揎椀膱�(bào)道。SUMO1(小泛素相關(guān)修飾蛋白1)修飾是一種重要的翻譯后修飾類型,已有文獻(xiàn)報(bào)道SUMO1具有增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞糖代謝的功能,然而,SUMO1參與調(diào)控腫瘤糖代謝的具體機(jī)制仍不清楚。本課題通過一系列實(shí)驗(yàn),證實(shí)SUMO1通過修飾PKM2進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞糖酵解過程及細(xì)胞增殖。方法回顧性分析73例肺腺癌患者的臨床病理資料,取癌組織標(biāo)本行PKM2的免疫組化檢查。分析肺腺癌患者PKM2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系,進(jìn)一步使用Kaplan Meier曲線分析肺腺癌患者PKM2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。通過體內(nèi)及體外蘇木化實(shí)驗(yàn),證實(shí)SUMO1是否可以修飾PKM2;通過SUMO修飾軟件預(yù)測可能的PKM2 SUMO1修飾位點(diǎn),并通過體內(nèi)及體外蘇木化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過~(18)F-FDG攝取,乳酸檢測,觀察SUMO1對腫瘤細(xì)胞糖代謝的影響;通過依賴性實(shí)驗(yàn)觀察SUMO1對糖代謝的影響是否依賴于PKM2。在A549細(xì)胞中過表達(dá)或敲除內(nèi)源性SUMO1基因,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR與蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)觀察PKM2 mRNA和蛋白水平的變化。通過~(18)F-FDG攝取,乳酸檢測,海馬技術(shù)觀察PKM2 SUMO1修飾對腫瘤細(xì)胞糖代謝及線粒體功能的影響;通過免疫沉淀技術(shù)獲得真核細(xì)胞來源的重組蛋白純化產(chǎn)物,然后檢測丙酮酸激酶活性;通過熒光素酶報(bào)道基因檢測及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察SUMO1修飾是否影響PKM2對HIF-1α轉(zhuǎn)錄共激活作用;通過細(xì)胞計(jì)數(shù),克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下異種移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察PKM2 SUMO1修飾對肺腺癌細(xì)胞A549增殖及裸鼠皮下成瘤能力的影響。結(jié)果PKM2的表達(dá)水平與肺腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)(p0.05)。與PKM2低表達(dá)肺腺癌患者相比,PKM2高表達(dá)肺腺癌患者的總體生存率(P=0.017)及術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率均較低(P=0.027)。體內(nèi)體外蘇木化實(shí)驗(yàn)證實(shí),PKM2可以被SUMO1修飾,第336位賴氨酸是其主要的修飾位點(diǎn)。使用小干擾技術(shù)在A549細(xì)胞中敲除SUMO1基因后PKM2蛋白量明顯減少,而PKM2 mRNA水平?jīng)]有變化;在細(xì)胞中過表達(dá)外源性SUMO1后,發(fā)現(xiàn)PKM2蛋白表達(dá)水平增加;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SUMO1通過抑制PKM2溶酶體途徑降解而影響其蛋白穩(wěn)定性。通過檢測細(xì)胞~(18)F-FDG攝取與乳酸產(chǎn)生,我們發(fā)現(xiàn)SUMO1修飾可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖代謝,并且是依賴于PKM2的。SUMO1修飾可以抑制PKM2丙酮酸激酶活性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞~(18)F-FDG攝取與乳酸產(chǎn)生。通過熒光素酶報(bào)道基因檢測與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),我們發(fā)現(xiàn),SUMO1修飾可以促進(jìn)PKM2對HIF-1α轉(zhuǎn)錄共激活作用。通過細(xì)胞計(jì)數(shù),克隆形成實(shí)驗(yàn)及裸鼠皮下異種移植瘤實(shí)驗(yàn),我們證實(shí),無論在體內(nèi)還是體外,SUMO1對PKM2蛋白修飾均可促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。結(jié)論綜上所述,本研究通過揭示PKM2 SUMO1修飾促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞糖酵解的分子機(jī)制,從而為日后腫瘤靶向治療提供了重要的理論依據(jù)。
【圖文】：

3C 3D圖3. PKM2免疫組化染色結(jié)果Figure 3. Immunohjistochemical staining for PKM2性染色率/陽性染色程度=（0/0）; 圖3B.陽性染色率/陽性染色程度=（1/1）；性染色率/陽性染色程度=（2/2）; 圖3D.陽性染色率/陽性染色程度=（3/3）。 PKM2與肺腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系過免疫組化染色結(jié)果分析 PKM2 的表達(dá)與 73 例肺腺癌患者臨床病理關(guān)系，結(jié)果顯示 PKM2 的表達(dá)水平與肺腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)分期相關(guān)（p<0.05），與患者的年齡、性別無關(guān)（p>0.05）（表 5）。表5. PKM2的表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性(n=73) 5. Relationship between PKM2 expression and Clinical-Pathologic CharacteristicsPKM2 expression P-vables Negative(n=43) Positive(n=30)

圖5. PKM2在體內(nèi)可以被SUMO1修飾Figure 5. PKM2 could be modified by SUMO1 in vivoT 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染 HA-PKM2 或 HA 空載，與 Flag-SUMO1。在完全 DME使用 NEM-PBS(20 mM NEM in PBS)清洗細(xì)胞并收集。使用 NEM-，HA 瓊脂糖珠對細(xì)胞裂解液行免疫沉淀，，樣品以抗 HA 與抗 t 分析。我們發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi) PKM2 可以被 SUMO1 修飾，為了支持我們使用體外 SUMO 修飾試劑盒來檢測 PKM2 在體外是否飾。首先我們通過大腸桿菌 DE3 表達(dá)，HIS 純化技術(shù)獲得 白。與范素化修飾類似，SUMO 修飾也是由一系列酶促反應(yīng)修飾的第一步是 SUMO 活化酶 E1 激活 SUMO1 羧基端并移至 SUMO 結(jié)合酶 E2，而這個(gè)過程依賴于 ATP 的。我們根制體外 SUMO 修飾體系，按要求加入所有成分后，一組加入
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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8 季晨陽,張義R

本文編號：2600994