【摘要】：目的:自然殺傷細(xì)胞(NK cells)具有良好的抗腫瘤應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)中我們將建立奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞模型,闡明NK細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖、遷移及侵襲能力的影響,從而探索與NK共培養(yǎng)的結(jié)直腸細(xì)胞內(nèi)miR-146b-5p的表達(dá)水平變化,闡明WBSCR22與miR-146b-5p之間的調(diào)節(jié)關(guān)系,最后探索miR-146b-5p在NK細(xì)胞抑制奧沙利鉑耐藥大腸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展中的作用。方法:將結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和DLD1用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),加入奧沙利鉑溶液建立耐藥細(xì)胞株。通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞的體外增殖活力和克隆形成能力。通過(guò)transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力的變化。荷瘤試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞的異體成瘤能力的影響。體內(nèi)外實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞中,WBSCR22的mRNA和蛋白的表達(dá)水平,以及miR-146b-5p的mRNA表達(dá)水平。通過(guò)miRNA在線靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站miRanda,克隆構(gòu)建了連接有WBSCR22基因3’UTR序列的雙熒光報(bào)告基因質(zhì)粒,并對(duì)預(yù)測(cè)的miR-146b-5p作用位點(diǎn)進(jìn)行突變得到突變質(zhì)粒。建立了穩(wěn)定敲低miR-146b-5p表達(dá)的細(xì)胞株,并與NK細(xì)胞共培養(yǎng)或共注射,探索OR-DLD1-anti-control,OR-DLD1-anti-miR-146b-5p,OR-RKO-anticontrol和OR-RKO-anti-miR-146b-5p細(xì)胞株的體內(nèi)外功能差異。結(jié)果:1在DLD1和RKO細(xì)胞基礎(chǔ)上,建立了耐藥細(xì)胞株并命名為OR-DLD1和OR-RKO,相對(duì)DLD1和RKO細(xì)胞,OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞在奧沙利鉑作用下細(xì)胞增殖活力和克隆形成能力都顯著性增強(qiáng)。2與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株OR-DLD1和OR-RKO的體外增殖活力、克隆形成、遷移及侵襲能力均顯著性下降,與NK細(xì)胞共注射的奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株OR-DLD1和OR-RKO的體內(nèi)成瘤能力顯著性下降。3通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),相對(duì)未與NK共培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞,與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞中,WBSCR22的mRNA表達(dá)水平均顯著性下調(diào)。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),相對(duì)未與NK共培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞,與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞中,WBSCR22的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均顯著性下調(diào)。相對(duì)與未與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞,與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)顯著性上調(diào)。我們提取BALB/c裸鼠體內(nèi)的OR-DLD1和OR-RKO移植瘤細(xì)胞中的miRNA,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),相對(duì)與未與NK細(xì)胞共注射的移植瘤細(xì)胞,與NK細(xì)胞共注射的移植瘤細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)顯著性上調(diào)。4雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明miR-146b-5p能顯著抑制連有WBSCR22的3’UTR野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性,而對(duì)突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性沒(méi)有明顯的影響。NK細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中連有WBSCR22的3’UTR野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著降低,而突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性沒(méi)有明顯的變化。5抑制miR-146b-5p的表達(dá)后,NK細(xì)胞對(duì)OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞在細(xì)胞活力、增殖、遷移及侵襲的抑制被顯著性削弱。結(jié)論:1 OR-DLD1和OR-RKO細(xì)胞是對(duì)奧沙利鉑耐藥的耐藥細(xì)胞株。2 NK細(xì)胞能抑制奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細(xì)胞株的體內(nèi)外細(xì)胞活力、增殖、遷移及侵襲能力。上述實(shí)驗(yàn)表明,NK細(xì)胞能通過(guò)上調(diào)miR-146b-5p的表達(dá)來(lái)抑制WBSCR22的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。miR-146b-5p能通過(guò)靶向WBSCR22的3’UTR抑制WBSCR22的表達(dá)。3 MiR-146b-5p是NK細(xì)胞抑制奧沙利鉑耐藥腸癌細(xì)胞細(xì)胞活力、增殖、遷移及侵襲的關(guān)鍵性效應(yīng)分子。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)用奧沙利鉑作用于結(jié)直腸癌細(xì)胞 DLD1 和 RKO 得到耐 OR-DLD1 和 OR-RKO。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，，在奧沙利鉑作用下，耐藥細(xì)胞株 OR-DLD1 相對(duì)于對(duì)照組的 DLD1 克隆形成數(shù)顯著上升，表現(xiàn)性（圖 1-1，A，p＜0.01）；奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株 OR-RKO 相對(duì)于對(duì)照組的形成數(shù)同樣顯著上升（圖 1-1，B，p＜0.01）。

圖 1-2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)奧沙利鉑耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞株的建立**，p<0.01。e 1-2 Establishment of colorectal cancer cell lines resistant to oxaliplatin by cck: the difference of cell proliferation capacity between DLD1 and control cells unatin; B: difference of cell proliferation capacity between RKO cell lines and conunder oxaliplatin; (**, p<0.01).論前奧沙利鉑（Oxaliplatin, OXA）是臨床治療結(jié)直腸癌的一線用藥[31于大腸癌的治療已有近二十年的時(shí)間，研究表明其能顯著性延長(zhǎng)患；大腸癌患者的中位生存期延長(zhǎng)至 24 個(gè)月，約 25%的患者無(wú)復(fù)發(fā)生年。相對(duì)單獨(dú)使用 5-氟尿嘧啶，奧沙利鉑聯(lián)合 5-氟尿嘧啶治療后，率由 15%提高為 54%�？ㄣK或順鉑等其他鉑類(lèi)藥物治療無(wú)效的轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Mariusz Panczyk;;Pharmacogenetics research on chemotherapy resistance in colorectal cancer over the last 20 years[J];World Journal of Gastroenterology;2014年29期

2 ;KRAS mutation testing in metastatic colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2012年37期

本文編號(hào)：2598951