【摘要】：目的:自然殺傷細胞(NK cells)具有良好的抗腫瘤應(yīng)用前景。本實驗中我們將建立奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細胞模型,闡明NK細胞對奧沙利鉑耐藥細胞的細胞活力、增殖、遷移及侵襲能力的影響,從而探索與NK共培養(yǎng)的結(jié)直腸細胞內(nèi)miR-146b-5p的表達水平變化,闡明WBSCR22與miR-146b-5p之間的調(diào)節(jié)關(guān)系,最后探索miR-146b-5p在NK細胞抑制奧沙利鉑耐藥大腸癌細胞惡性進展中的作用。方法:將結(jié)直腸癌細胞RKO和DLD1用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),加入奧沙利鉑溶液建立耐藥細胞株。通過CCK-8細胞增殖實驗,克隆形成實驗檢測OR-DLD1和OR-RKO細胞的體外增殖活力和克隆形成能力。通過transwell小室細胞侵襲實驗檢測OR-DLD1和OR-RKO細胞的體外遷移及侵襲能力的變化。荷瘤試驗檢測NK細胞對OR-DLD1和OR-RKO細胞的異體成瘤能力的影響。體內(nèi)外實時熒光定量PCR和Western blot實驗檢測OR-DLD1和OR-RKO細胞中,WBSCR22的mRNA和蛋白的表達水平,以及miR-146b-5p的mRNA表達水平。通過miRNA在線靶標預測網(wǎng)站miRanda,克隆構(gòu)建了連接有WBSCR22基因3’UTR序列的雙熒光報告基因質(zhì)粒,并對預測的miR-146b-5p作用位點進行突變得到突變質(zhì)粒。建立了穩(wěn)定敲低miR-146b-5p表達的細胞株,并與NK細胞共培養(yǎng)或共注射,探索OR-DLD1-anti-control,OR-DLD1-anti-miR-146b-5p,OR-RKO-anticontrol和OR-RKO-anti-miR-146b-5p細胞株的體內(nèi)外功能差異。結(jié)果:1在DLD1和RKO細胞基礎(chǔ)上,建立了耐藥細胞株并命名為OR-DLD1和OR-RKO,相對DLD1和RKO細胞,OR-DLD1和OR-RKO細胞在奧沙利鉑作用下細胞增殖活力和克隆形成能力都顯著性增強。2與NK細胞共培養(yǎng)的奧沙利鉑耐藥細胞株OR-DLD1和OR-RKO的體外增殖活力、克隆形成、遷移及侵襲能力均顯著性下降,與NK細胞共注射的奧沙利鉑耐藥細胞株OR-DLD1和OR-RKO的體內(nèi)成瘤能力顯著性下降。3通過實時熒光定量PCR實驗我們發(fā)現(xiàn),相對未與NK共培養(yǎng)的對照細胞,與NK細胞共培養(yǎng)的OR-DLD1和OR-RKO細胞中,WBSCR22的mRNA表達水平均顯著性下調(diào)。通過Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn),相對未與NK共培養(yǎng)的對照細胞,與NK細胞共培養(yǎng)的OR-DLD1和OR-RKO細胞中,WBSCR22的蛋白質(zhì)的表達水平均顯著性下調(diào)。相對與未與NK細胞共培養(yǎng)的細胞,與NK細胞共培養(yǎng)的細胞中miR-146b-5p表達顯著性上調(diào)。我們提取BALB/c裸鼠體內(nèi)的OR-DLD1和OR-RKO移植瘤細胞中的miRNA,并通過實時熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn),相對與未與NK細胞共注射的移植瘤細胞,與NK細胞共注射的移植瘤細胞中miR-146b-5p表達顯著性上調(diào)。4雙熒光報告基因?qū)嶒灡砻鱩iR-146b-5p能顯著抑制連有WBSCR22的3’UTR野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性,而對突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有明顯的影響。NK細胞共培養(yǎng)的細胞中連有WBSCR22的3’UTR野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著降低,而突變型質(zhì)粒的熒光素酶活性沒有明顯的變化。5抑制miR-146b-5p的表達后,NK細胞對OR-DLD1和OR-RKO細胞在細胞活力、增殖、遷移及侵襲的抑制被顯著性削弱。結(jié)論:1 OR-DLD1和OR-RKO細胞是對奧沙利鉑耐藥的耐藥細胞株。2 NK細胞能抑制奧沙利鉑耐藥結(jié)直腸癌細胞株的體內(nèi)外細胞活力、增殖、遷移及侵襲能力。上述實驗表明,NK細胞能通過上調(diào)miR-146b-5p的表達來抑制WBSCR22的mRNA及蛋白的表達水平。miR-146b-5p能通過靶向WBSCR22的3’UTR抑制WBSCR22的表達。3 MiR-146b-5p是NK細胞抑制奧沙利鉑耐藥腸癌細胞細胞活力、增殖、遷移及侵襲的關(guān)鍵性效應(yīng)分子。
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文通過長時間持續(xù)用奧沙利鉑作用于結(jié)直腸癌細胞 DLD1 和 RKO 得到耐 OR-DLD1 和 OR-RKO。細胞克隆形成實驗顯示，，在奧沙利鉑作用下，耐藥細胞株 OR-DLD1 相對于對照組的 DLD1 克隆形成數(shù)顯著上升，表現(xiàn)性（圖 1-1，A，p＜0.01）；奧沙利鉑耐藥細胞株 OR-RKO 相對于對照組的形成數(shù)同樣顯著上升（圖 1-1，B，p＜0.01）。

圖 1-2 CCK-8 實驗檢測對奧沙利鉑耐藥的結(jié)直腸癌細胞株的建立**，p<0.01。e 1-2 Establishment of colorectal cancer cell lines resistant to oxaliplatin by cck: the difference of cell proliferation capacity between DLD1 and control cells unatin; B: difference of cell proliferation capacity between RKO cell lines and conunder oxaliplatin; (**, p<0.01).論前奧沙利鉑（Oxaliplatin, OXA）是臨床治療結(jié)直腸癌的一線用藥[31于大腸癌的治療已有近二十年的時間，研究表明其能顯著性延長患；大腸癌患者的中位生存期延長至 24 個月，約 25%的患者無復發(fā)生年。相對單獨使用 5-氟尿嘧啶，奧沙利鉑聯(lián)合 5-氟尿嘧啶治療后，率由 15%提高為 54%�？ㄣK或順鉑等其他鉑類藥物治療無效的轉(zhuǎn)移
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Mariusz Panczyk;;Pharmacogenetics research on chemotherapy resistance in colorectal cancer over the last 20 years[J];World Journal of Gastroenterology;2014年29期

2 ;KRAS mutation testing in metastatic colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2012年37期

本文編號：2598951