【摘要】：胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是一種人類常見的高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤,多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期。胰腺星形細(xì)胞(Pancreatic stellate cells,PSCs)作為一種特殊的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer associated fibroblast,CAF)在PDAC中異�；罨⒋龠M(jìn)PDAC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥,但有關(guān)PSCs影響PDAC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為機(jī)制的研究十分有限。越來越多證據(jù)表明,CAFs可通過釋放外泌體微小RNA(MicroRNA,miRNA)對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)報(bào)道,具有促癌作用的miR-21在PDAC活化的PSCs外泌體中顯著上調(diào)。我們通過癌癥和腫瘤基因圖譜(The cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)高水平miR-21與胰腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)及更短的生存期密切相關(guān)。然而,PSCs來源的外泌體miR-21調(diào)節(jié)PDAC生物學(xué)行為的潛在機(jī)制尚不明確。因此,本研究第一部分在細(xì)胞水平探討了 PSCs外泌體中miR-21對(duì)PDAC細(xì)胞遷移能力的影響及其可能的機(jī)制;此外,為了發(fā)現(xiàn)與PDAC患者預(yù)后相關(guān)的新的分子標(biāo)志物,本研究第二部分結(jié)合PDAC患者臨床資料,重點(diǎn)探討了應(yīng)激相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白1(Stress associated endoplasmic reticulum protein 1,SERP1)在胰腺癌患者預(yù)后判斷中的潛在價(jià)值。兩部分研究旨在為PSCs外泌體介導(dǎo)的PDAC轉(zhuǎn)移研究提供初步的理論基礎(chǔ),同時(shí)探索PDAC患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。第一部分胰腺星形細(xì)胞外泌體miR-21對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響及機(jī)制1.文獻(xiàn)報(bào)道胰腺癌PSCs外泌體中miR-21相對(duì)水平顯著上調(diào),生物信息學(xué)方法進(jìn)一步分析miR-21對(duì)PDAC進(jìn)展的影響及潛在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21高表達(dá)的患者具有更高的T和N分期,同時(shí)具有更短的總生存期(Overall survival,OS)和無病生存期(Disease-free survival,DFS)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)miR-21的靶基因主要參與調(diào)節(jié)Ras和Erk信號(hào)通路,TCGA數(shù)據(jù)庫中基因突變數(shù)據(jù)顯示PDAC患者中K-ras基因突變頻率高達(dá)91%,Ras信號(hào)通路過度活化。因此,數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示PSCs釋放的高水平miR-21可能通過參與Ras信號(hào)通路活化促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展。2.胰腺癌PSCs及腫瘤細(xì)胞(PANC-1、AsPC-1和MIAPaCa-2)外泌體miR-21表達(dá)水平被定量分析。首先利用手術(shù)切除的新鮮胰腺癌組織在體外培養(yǎng)原代PSCs,然后經(jīng)超速離心法收集PSCs培養(yǎng)基中的外泌體,透射電子顯微鏡和western blot對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定。實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn),活化PSCs外泌體中miR-21相對(duì)水平高于PANC-1、AsPC-1、MIAPaCa-2以及經(jīng)全反式維甲酸(All-trans-retinoicacid,ATRA)去活化的PSCs,結(jié)果證實(shí)胰腺癌PSCs中具有較高水平的miR-21。3.為觀察PSCs外泌體miR-21能否被腫瘤細(xì)胞攝取,在體外,用PKH67綠色熒光染料標(biāo)記PSCs外泌體并孵育PANC-1和MIAPaCa-2細(xì)胞,3小時(shí)后,熒光顯微鏡觀察到標(biāo)記有綠色熒光的外泌體已進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部。接下來,qRT-PCR進(jìn)一步分析腫瘤細(xì)胞中miR-21相對(duì)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未處理的細(xì)胞相比,外泌體處理后的腫瘤細(xì)胞中miR-21相對(duì)水平顯著上調(diào),證實(shí)PSCs細(xì)胞外泌體中miR-21能被PDAC細(xì)胞攝取。4.為觀察PSCs外泌體miR-21對(duì)PDAC細(xì)胞惡性表型的影響,首先用PSCs外泌體處理PANC-1和MIAPaCa-2細(xì)胞,PSCs來源的外泌體能夠明顯增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力。Western blot和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSCs外泌體處理后的PDAC細(xì)胞,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平發(fā)生改變,同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶2和9(Matrix metalloprotein 2 and 9,MMP-2/9)活性增強(qiáng)。為明確PSCs外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及增強(qiáng)EMT的能力是否由miR-21所介導(dǎo),miR-21 inhibitor被轉(zhuǎn)染至活化的PSCs中抑制其內(nèi)源性miR-21表達(dá),然后收集外泌體處理PDAC細(xì)胞,結(jié)果下調(diào)PSCs外泌體中miR-21水平后可明顯逆轉(zhuǎn)外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞遷移及EMT過程,同時(shí)還可降低PDAC細(xì)胞中MMP-2/9 活性。5.根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,western blot證實(shí)PSCs外泌體miR-21可上調(diào)PDAC細(xì)胞中Ras、磷酸化Erk及磷酸化Akt表達(dá)水平。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)分析發(fā)現(xiàn) Ras 和 Erk 信號(hào)通路中 RAS p21 蛋白激活子 1(RAS p21 protein activator 1,RASA1)是一個(gè)關(guān)鍵基因,既是 miR-21的關(guān)鍵靶基因,又是Ras信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。Western blot結(jié)果也證實(shí)PSCs外泌體miR-21可通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞中RASA1表達(dá)促進(jìn)Ras/Erk/Akt通路活化。6.經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子活性芯片初篩發(fā)現(xiàn),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)在活化 PSCs 中的活性是經(jīng) ATRA誘導(dǎo)去活化PSCs活性的10倍。由于STAT3是miR-21的轉(zhuǎn)錄因子,在活化PSCs中轉(zhuǎn)染si-STAT3下調(diào)STAT3表達(dá)后,活化PSCs中內(nèi)源性miR-21相對(duì)水平下降,其外泌體中miR-21水平也相應(yīng)下調(diào)。第二部分SERP1與胰腺導(dǎo)管腺癌患者預(yù)后間關(guān)系及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中作用1.GEO數(shù)據(jù)庫(Gene expression omnibus,GEO)下載PDAC患者癌及癌旁組織表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),利用R語言分析差異表達(dá)mRNA。與癌旁組織相比,SERP1 mRNA水平在PDAC組織中顯著上調(diào)。通過分析人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(Human protein atlas,HPA)中PDAC患者免疫組化數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)PDAC組織中SERP1的蛋白表達(dá)水平也顯著高于癌旁組織。組織芯片的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)SERP1在PDAC中表達(dá)水平顯著上調(diào)。2.從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得SERP1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)及患者臨床資料,根據(jù)mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將PDAC患者分為SERP1高表達(dá)組和SERP1低表達(dá)組,分析SERP1表達(dá)水平與PDAC患者預(yù)后間關(guān)系。隨著SERP1 mRNA表達(dá)水平的升高,患者臨床分期越高,特別是T和N分期;Kaplan-Meier(K-M)生存分析發(fā)現(xiàn)SERP1高表達(dá)患者具有更短的OS和DFS;Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型(Cox proportional-hazards model,也稱為Cox回歸)分析發(fā)現(xiàn)SERP1表達(dá)水平是影響PDAC患者OS及DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。3.基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)結(jié)果證實(shí)SERP1高表達(dá)與細(xì)胞凋亡有關(guān);蛋白質(zhì)間相互作用(Protein-protein interaction,PPI)和基因本體(Gene ontology,GO)分析發(fā)現(xiàn) SERP1 與 SRP 受體 β 亞基(SRP receptor beta subunit,SRPRB)/NF-κB信號(hào)通路有關(guān);相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)SERP1 mRNA水平與NF-κB正相關(guān),SRPRB mRNA水平與NF-κB負(fù)相關(guān)。4.轉(zhuǎn)染si-SERP1下調(diào)PANC-1細(xì)胞中SERP1表達(dá),腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增加。Western blot證實(shí)下調(diào)SERP1表達(dá)可以增加SRPRB表達(dá),SRPRB過表達(dá)可以抑制NF-κB活化,最終促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究第一部分結(jié)果表明,活化的PSCs中轉(zhuǎn)錄因子STAT3活性增強(qiáng)可以上調(diào)miR-21水平,內(nèi)源性miR-21經(jīng)外泌體釋放到胞外被臨近PDAC細(xì)胞攝取,通過靶向RASA1促進(jìn)Ras/Erk及Ras/Akt信號(hào)通路活化并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移能力。本研究第二部分結(jié)果表明,SERP1高表達(dá)與PDAC患者更高的臨床分期以及更短的生存期相關(guān),下調(diào)SERP1表達(dá)水平可以增加SRPRB表達(dá)進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路活化,最終促進(jìn)PANC-1細(xì)胞凋亡。因此,SERP1有望成為PDAC患者一個(gè)新的潛在預(yù)后標(biāo)志物,通過靶向SERP1可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

為進(jìn)一步分析ｍｉＲ－２１影響ＰＤＡＣ預(yù)后的可能原因，ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ在線數(shù)據(jù)庫逡逑確定了邋３８１個(gè)ｍｉＲ－２１的靶基因。將所有靶基因進(jìn)行ＫＥＧＧ分析，結(jié)果顯示這些逡逑靶基因主要富集在Ｒａｓ和Ｅｒｋ信號(hào)通路（圖２Ａ）。ＴＣＧＡ數(shù)據(jù)庫基因突變數(shù)據(jù)顯逡逑示，Ｋ－ｒａｓ基因在ＰＤＡＣ組織中的突變率高達(dá)９１邋％，而Ｂ－ｍｆ基因突變率僅為４％。逡逑Ｋ－ｒａｓ基因除少數(shù)擴(kuò)增和缺失外，大部分為錯(cuò)義突變（圖２Ｂ）。因此，ｍｉＲ－２１很逡逑可能通過參與調(diào)節(jié)Ｒａｓ信號(hào)通路活化影響胰腺癌進(jìn)展及預(yù)后。逡逑Ａ逡逑Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ逡逑ＴＧＦ－ｂｃｔａ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋？邋■■■■■■逡逑ＦｏｘＯ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ－逡逑Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ邋■逡逑Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ邋ｃａｎｃｅｒ邋？■ＨＵＨ逡逑Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ

中提取外泌體，離心結(jié)束后管壁可見白色沉淀，用適量ＰＢＳ溶解白色沉淀。透逡逑射電子顯微鏡和ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方法用于外泌體鑒定。透射電子顯微鏡下可觀察到逡逑３０？１００邋ｎｍ大小的具有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡（圖３Ａ），，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)到這些囊泡逡逑表達(dá)外泌體特有標(biāo)志ＣＤ６３及ＣＤ９邋（圖３Ｂ）。逡逑接下來，ｑＲＴ－ＰＣＲ用于檢測(cè)ｍｉＲ－２１在ＰＳＣｓ和ＰＤＡＣ細(xì)胞外泌體中表達(dá)水逡逑平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＰＳＣｓ外泌體中ｍｉＲ－２１水平高于ＰＡＮＣ－１、ＭＩＡＰａＣａ－２以及逡逑ＡｓＰＣ－１細(xì)胞。在三株ＰＤＡＣ細(xì)胞中，ｍｉＲ－２１在ＰＡＮＣ－１細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高逡逑于ＭＩＡＰａＣａ－２和ＡｓＰＣ－１細(xì)胞（圖３Ｃ）。接下來，我們進(jìn)一步分析了邋ＰＳＣｓ和三逡逑株ＰＤＡＣ細(xì)胞中內(nèi)源性ｍｉＲ－２１相對(duì)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＰＳＣｓ內(nèi)源性ｍｉＲ－２１水平同逡逑樣高于ＰＤＡＣ細(xì)胞，并且這些細(xì)胞外泌體中ｍｉＲ－２１水平與內(nèi)源性ｍｉＲ－２１水平逡逑相一致（圖３Ｄ）。逡逑靜息狀態(tài)的ＰＳＣｓ通常存在于正常胰腺組織中，在腫瘤發(fā)生時(shí)ＰＳＣｓ異常活逡逑化
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 方國強(qiáng);吳炳禮;李恩民;許麗艷;;miR-21與腫瘤[J];癌變.畸變.突變;2010年01期

本文編號(hào)：2598882