【摘要】：研究背景幽門螺旋桿菌(HPylori)作為世界衛(wèi)生組織確定的I類致癌物,在胃癌發(fā)生中起重要作用。細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性日益受到關(guān)注,但其在幽門螺桿菌感染導(dǎo)致的胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制并不明確。真核翻譯起始因子2 α亞單位(eIF2α)激酶GCN2(general control nonderepressible-2)是蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子,能夠參與細(xì)胞應(yīng)激、代謝、自噬、炎癥等多種反應(yīng),并已被初步證實(shí)在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但其在幽門螺桿菌感染導(dǎo)致的惡性變中的作用研究較少。因此,研究幽門螺桿菌是否通過(guò)調(diào)控GCN2影響自噬過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子如Beclin1(BECN1)的表達(dá),參與自噬體的形成和成熟從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞自噬發(fā)生及相關(guān)分子作用機(jī)制,對(duì)于更好地理解幽門螺桿菌感染與胃癌發(fā)生的相關(guān)性十分必要。研究目的1.研究在胃癌發(fā)生過(guò)程中,幽門螺桿菌對(duì)GCN2表達(dá)的調(diào)控作用;2.探究在胃癌細(xì)胞自噬中,GCN2的作用以及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制。研究方法1.細(xì)胞分子水平通過(guò)Western blot和qRT-PCR法檢測(cè)四種胃粘膜上皮細(xì)胞來(lái)源的永生化細(xì)胞系GES-1及胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS,BGC-823和SGC-7901中GCN2的本底表達(dá)情況。胃癌細(xì)胞感染幽門螺桿菌或通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,利用Western blot法檢測(cè)GCN2及BECN1的表達(dá)變化;回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LPS是否能夠通過(guò)GCN2影響胃癌細(xì)胞自噬;透射電鏡觀察細(xì)胞自噬小體的形成情況。轉(zhuǎn)染GCN2的特異小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)后通過(guò)Western blot檢測(cè)BECN1的表達(dá)變化;克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GCN2對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。通過(guò)回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GCN2通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子4(ATF4)途徑調(diào)控BECN1的可能性。2.動(dòng)物水平進(jìn)行裸鼠皮下成瘤,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,測(cè)量腫瘤大小。通過(guò)Western blot,qRT-PCR,免疫組化和透射電鏡觀察,檢測(cè)GCN2在胃癌發(fā)生中的作用及調(diào)控細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。3.人體胃癌組織病理標(biāo)本水平通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)12對(duì)人體胃癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本中GCN2及BECN1的表達(dá)情況,并結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析GCN2和BECN1在胃癌發(fā)生中表達(dá)的相關(guān)性及與疾病預(yù)后的關(guān)系。研究結(jié)果1.細(xì)胞分子水平GCN2在四種胃粘膜上皮細(xì)胞來(lái)源的永生化細(xì)胞株及胃癌細(xì)胞系中均穩(wěn)定表達(dá)。幽門螺桿菌感染及LPS刺激后,GCN2和BECN1的表達(dá)均升高,并與作用時(shí)間及濃度呈一定的正相關(guān)性�；貜�(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS能夠通過(guò)GCN2影響胃癌細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)和自噬小體的生成。在胃癌細(xì)胞系中特異性抑制GCN2表達(dá)可使ATF4和BECN1表達(dá)同步降低,從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力。GCN2可通過(guò)ATF4途徑調(diào)控BECN1的表達(dá)從而影響胃癌細(xì)胞自噬。2.動(dòng)物水平敲除GCN2基因后,裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)受到抑制,自噬相關(guān)蛋白表達(dá)也同時(shí)下降,細(xì)胞自噬小體形成減少。3.人體胃癌組織病理標(biāo)本水平結(jié)合免疫組化檢測(cè)及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析,GCN2在12對(duì)人體胃癌組織病理標(biāo)本中顯著高表達(dá);自噬相關(guān)蛋白BECN1在胃癌中同時(shí)高表達(dá),與GCN2的表達(dá)具有正相關(guān)性。GCN2的表達(dá)情況與胃癌病人的預(yù)后具有相關(guān)性。結(jié)論GCN2在人體胃癌組織中高表達(dá);幽門螺桿菌可通過(guò)GCN2調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞自噬,參與胃癌發(fā)生。此研究初步探討了GCN2在幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃癌發(fā)生中的重要作用及相關(guān)分子調(diào)控調(diào)控,為胃癌的早期預(yù)防和治療提供了一定的新理論依據(jù)。
【圖文】：

圖１：邋ＧＣＮ２在人胃粘膜上皮細(xì)胞來(lái)源的胃癌細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。逡逑（Ａ）通過(guò)ＱＰＣＲ分析胃癌細(xì)胞系中ＧＣＮ２的ｍＲＮＡ表達(dá)水平；（Ｂ）通過(guò)ｗｅｓｔｅｒｎ分析ＧＣＮ２在胃癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平，，ＧＣＮ２在ＧＥＳ－１、ＡＧＳ、ＢＧＣ８２３、逡逑ＳＧＣ７９０１中均穩(wěn)定表達(dá)。逡逑３４逡逑

圖３邋：邋ＬＰＳ刺激能夠通過(guò)高表達(dá)ＧＣＮ２促進(jìn)胃癌細(xì)胞自噬。逡逑（Ａ）用不同濃度的邋ＬＰＳ邋（１００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ）刺激胃癌細(xì)胞邋ＡＧＳ逡逑和邋ＢＧＣ－８２３邋６ｈ邋后邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋檢測(cè)邋ＧＣＮ２邋與邋ＢＥＣＮ１邋的表達(dá)水平；（Ｂ）邋ＡＧＳ邋和邋ＢＧＣ－逡逑８２３細(xì)胞轉(zhuǎn)染ＧＣＮ２的干擾ＲＮＡ７２后收集細(xì)胞進(jìn)行ｗｅｓｔｅｒｎ檢測(cè)ＢＥＣＮ１的表達(dá)逡逑變化。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;CagA~+ H.pylori Induces Akt1 Phosphorylation and Inhibits Transcription of p21~(WAF1/CIP1) and p27~(KIP1) via PI3K/Akt1 Pathway[J];Biomedical and Environmental Sciences;2010年04期

2 ;Potential therapeutic significance of increased expression of aryl hydrocarbon receptor in human gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2009年14期

本文編號(hào)：2598080