【摘要】：研究背景及目的:肺癌發(fā)病率和死亡率在我國(guó)居各類(lèi)癌癥中均位居前列,嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康。肺腺癌是肺癌的主要病理類(lèi)型之一。針對(duì)肺腺癌的藥物層出不窮,但是臨床療效卻不盡如人意。由于肺癌的早期癥狀不明顯,故當(dāng)患者確診肺癌時(shí),通常已經(jīng)錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)。腫瘤代謝是當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。腫瘤細(xì)胞的代謝特征與正常組織內(nèi)的細(xì)胞差異較大,針對(duì)某些腫瘤代謝特征的靶向藥物被認(rèn)為是腫瘤藥物研發(fā)的新方向。生物信息學(xué)是一門(mén)新興的生物醫(yī)學(xué)與信息學(xué)的交叉學(xué)科,目前已被廣泛運(yùn)用于基因篩查、分子診斷等領(lǐng)域。本研究基于臨床患者數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)技術(shù),篩選出潛在的肺癌預(yù)后因子,并通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),探討該指標(biāo)作為肺腺癌治療靶點(diǎn)的可能性和應(yīng)用價(jià)值。研究方法:我們運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)人類(lèi)腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中的肺腺癌組織樣本進(jìn)行高通量篩查。篩選出差異表達(dá)明顯的基因。同時(shí)我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中樣本附帶的臨床隨訪信息與該樣本的基因表達(dá)信息合并后進(jìn)行Kaplan-Meier分析,繪制生存曲線,再利用單因素COX回歸模型,探討差異表達(dá)的基因作為預(yù)后指標(biāo)的應(yīng)用價(jià)值。此外,我們還從山東省立醫(yī)院組織庫(kù)中調(diào)取肺腺癌的臨床組織,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)生物信息學(xué)分析中篩選出的基因進(jìn)行驗(yàn)證。篩選出潛在的預(yù)后基因后,我們運(yùn)用抑制劑和轉(zhuǎn)染小干擾RNA對(duì)該基因進(jìn)行抑制或敲除。應(yīng)用SRB染色法測(cè)定肺腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)及藥物的半數(shù)抑制濃度;然后我們通過(guò)劃痕試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn),研究抑制劑或小干擾RNA對(duì)抑制肺腺癌細(xì)胞系的侵襲、遷移能力的作用;另外,我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡;接著我們利用皮下種植瘤技術(shù)研究不同處理組對(duì)動(dòng)物體內(nèi)腫瘤增殖的作用。研究結(jié)果:與癌旁組織相比,UGT1A3在肺腺癌組織內(nèi)高表達(dá),差異倍數(shù)大于103(p0.0001),且UGT1A3的高表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)(HR=1.500,95%CI:1.053-2.138,p=0.0247)�；蚋患治霰砻�,UGT1A3的作用集中在藥物的體內(nèi)代謝過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)中,敲除UGT1 A3能夠顯著抑制A549細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡(p0.0001)。運(yùn)用UGT1A3的抑制劑Hesperetin能夠?qū)549細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,IC50為 125.006±9.591μM,95%可信區(qū)間為121.425μM-128.588μM。同時(shí),Hesperetin能夠抑制A549細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡,抑制侵襲和遷移。Hesperetin和卡鉑聯(lián)用能夠顯著增加A549細(xì)胞對(duì)卡鉑的敏感性:聯(lián)合用藥組中卡鉑的IC50為26.110±1.797μM,95%可信區(qū)間為25.439-26.781μM,與單用卡鉑組相比,IC50減少為單用組的1/6。而在HBEC細(xì)胞系中,Hesperetin和卡鉑聯(lián)用能夠顯著拮抗卡鉑的殺傷作用。相似地,聯(lián)合用藥組中,細(xì)胞增殖的抑制程度、凋亡數(shù)量和程度均顯著高于單獨(dú)用藥組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該聯(lián)合用藥方案在動(dòng)物體內(nèi)的效果與體外實(shí)驗(yàn)相似,聯(lián)合用藥組的腫瘤體積顯著小于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(p0.0001)。結(jié)論:UGT1 A3是肺腺癌中潛在的預(yù)后因子,其抑制劑Hesperetin能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)凋亡,抑制侵襲和遷移,并能在增加肺腺癌細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的敏感性的同時(shí),減少鉑類(lèi)對(duì)正常支氣管上皮細(xì)胞的殺傷作用。
【圖文】：

圖２．邋（Ａ）ＵＧＴ１Ａ３的敲除效率，我們利用ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染來(lái)敲除ＵＧＴ１Ａ３，結(jié)果逡逑顯示ｓｉＲＮＡ的敲除效率為３０％？５０％。（Ｂ）敲除ＵＧＴ１Ａ３對(duì)Ａ５４９細(xì)胞增殖的影逡逑響，我們利用磺酰羅丹明Ｂ邋（ＳＲＢ）染色法，對(duì)不同處理組的細(xì)胞于一定時(shí)間間逡逑隔后收樣和固定，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，敲除ＵＧＴ１Ａ３逡逑能夠顯著抑制Ａ５４９細(xì)胞增殖（ｐ＜０．０００１）。（Ｃ）Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ雙染色法檢測(cè)細(xì)逡逑胞凋亡，紅色為ＰＩ染色的凋亡細(xì)胞，黃綠色為Ｃａｌｃｅｉｎ染色的活細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，逡逑敲除ＵＧＴ１Ａ３對(duì)Ａ５４９細(xì)胞的凋亡無(wú)顯著影響（ｐ＞０．０５）。（Ｄ）和（Ｅ）克隆形逡逑成實(shí)驗(yàn)，將一定數(shù)目的處理后的細(xì)胞接種到孔內(nèi)，一定時(shí)間后固定染色，結(jié)果表逡逑明，ＵＧＴ１Ａ３組克隆形成數(shù)顯著少于對(duì)照組（ｐ＜０．０００１），提示ＵＧＴ１Ａ３在Ａ５４９逡逑細(xì)胞的增殖中扮演重要角色。逡逑

圖３．邋（Ａ）邋Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ對(duì)Ａ５４９細(xì)胞的殺傷作用。ＳＲＢ染色法繪制劑量－殺傷曲線，逡逑經(jīng)計(jì)算，ＩＣ５０為邋１２５．００６±９．５９１ｎＭ，９５％可信區(qū)間為邋１２１．４２５ｎＭ－１２８．５８８ｐＭ。（Ｂ）逡逑Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ對(duì)Ａ５４９細(xì)胞增殖的影卩向，與對(duì)照組相比，Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ能夠顯著抑制細(xì)逡逑胞增殖（ｐＯ．ＯＯＯｌ）。（Ｃ）Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，，結(jié)果顯示，低逡逑濃度的Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ能夠輕微誘導(dǎo)Ａ５４９細(xì)胞凋亡。（Ｄ）和（Ｅ）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)逡逑胞侵襲遷移能力，血清濃度為１％，以0小時(shí)的劃痕間距為參照，每隔一定時(shí)間逡逑對(duì)同一位置拍照，測(cè)量劃痕間距。與對(duì)照組相比，Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ能夠顯著抑制Ａ５４９逡逑細(xì)胞的侵襲和遷移（Ｐ＜0．00５）。（Ｆ）和（Ｇ）克隆形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞接種個(gè)數(shù)為每逡逑孑Ｌ邋２００個(gè)，生長(zhǎng)時(shí)間為２周。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，低濃度Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ即可逡逑顯著抑制Ａ５４９細(xì)胞系的增殖（ｐ＜０．００５）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 張倫;鉑類(lèi)抗癌藥物市場(chǎng)分析[J];中國(guó)藥房;2003年03期

本文編號(hào)：2597388