【摘要】：目的:研究多發(fā)性骨髓瘤(MM)細(xì)胞源性外泌體對正常人CD4~+T、CD8~+T及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量及功能的影響,闡明骨髓瘤細(xì)胞外泌體對T細(xì)胞免疫的作用;研究多發(fā)性骨髓瘤患者血漿外泌體長鏈非編碼RNA(lncRNA)H19表達(dá)水平與疾病療效的相關(guān)性,闡明lncRNA H19在硼替佐米耐藥發(fā)生中的作用并初步探索其機(jī)制。內(nèi)容:分選健康供者和MM患者CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞和CD4~+CD25~+CD127~(dim)T細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,Treg),與人骨髓瘤細(xì)胞系(OPM2,U266)外泌體共培養(yǎng),檢測T細(xì)胞凋亡、增殖,CD8~+T細(xì)胞穿孔素、顆粒酶B及Treg細(xì)胞IL-10和TGF-β的變化。檢測健康供者血漿與MM患者血漿、外泌體和分選CD138~+細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19水平,通過耐硼替佐米骨髓瘤細(xì)胞系的培養(yǎng),闡明lncRNA H19在骨髓瘤耐藥發(fā)生中的作用。方法:第一部分MM細(xì)胞源性外泌體參與T細(xì)胞免疫的作用研究。采用超速離心法和外泌體提取試劑盒進(jìn)行骨髓瘤細(xì)胞外泌體的提取,并應(yīng)用透射電鏡觀察骨髓瘤細(xì)胞外泌體的形態(tài)。磁珠分選健康供者和MM患者CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞和CD4~+CD25~+CD127~(dim)T細(xì)胞,與骨髓瘤(OPM2,U266)源性外泌體進(jìn)行共培養(yǎng)48h;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測上述T細(xì)胞的凋亡率,應(yīng)用CCK8試劑盒檢測T細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓瘤外泌體對CD8~+T細(xì)胞分泌穿孔素、顆粒酶B功能的影響,應(yīng)用ELISA方法檢測骨髓瘤外泌體對Treg細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β功能的影響。第二部分lncRNA H19參與多發(fā)性骨髓瘤硼替佐米耐藥的作用研究。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測健康供者血漿和MM患者血漿、外泌體及CD138~+瘤細(xì)胞的lncRNA H19水平,并根據(jù)骨髓瘤患者病情進(jìn)行分組,比較初治、緩解及難治復(fù)發(fā)患者與健康供者血漿中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)水平;體外培養(yǎng)MM細(xì)胞系(OPM2、U266和LP1),加入硼替佐米后,利用CCK8和Annexin V方法檢測其增殖和凋亡,以觀察其對硼替佐米藥物的敏感性,并采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測MM細(xì)胞系lncRNA H19水平;通過逐漸增加硼替佐米藥物濃度的方法,培養(yǎng)耐硼替佐米的MM細(xì)胞系,并比較lncRNA H19水平變化;采用慢病毒轉(zhuǎn)染lncRNA H19,使其在MM細(xì)胞系(OPM2、U266)中過表達(dá),檢測過表達(dá)后MM細(xì)胞系硼替佐米敏感性的變化;采用Western blot方法檢測敏感及耐藥U266中NF-κB通路、AKT水平,實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測MDR1、TRX水平變化。結(jié)果:第一部分MM細(xì)胞源性外泌體參與T細(xì)胞免疫的作用研究采用外泌體試劑盒法和超速離心法成功分離得到骨髓瘤細(xì)胞來源的外泌體,并通過電鏡觀察,兩者形態(tài)無明顯差別。1、骨髓瘤細(xì)胞(OPM2、U266)外泌體與正常CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,CD4~+T細(xì)胞凋亡率在OPM2組(6.24±1.24%)和U266組(5.42±1.07%)均明顯高于對照組(4.37±0.96%)(P=0.0049,P=0.0007),而OPM2和U266外泌體共培養(yǎng)兩組之間凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。骨髓瘤細(xì)胞(OPM2、U266)外泌體與MM患者CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,MM患者CD4~+T細(xì)胞凋亡率在OPM2組(14.56±4.65%)和U266組(16.42±5.08%)較對照組(13.83±5.69%)有增高趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、健康供者CD4~+T細(xì)胞存活率在OPM2組(95.34±4.58%)和U266組(85.45±6.09%)較無外泌體組(100%)下降(P=0.331,P=0.0358),后者對CD4~+T的增殖抑制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MM患者CD4~+T細(xì)胞存活率在OPM2組與U266組細(xì)胞增殖活性分別為98.61±2.80%和100.02±5.48%,與對照組相比,p值均0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、骨髓瘤細(xì)胞(OPM2、U266)外泌體與正常CD8~+T細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,CD8~+T細(xì)胞凋亡率在OPM2組(9.97±1.28%)和U266組(11.00±1.75%)均較對照組(16.12±2.95%)明顯降低(P=0.021,P=0.018),而OPM2和U266兩組之間凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);骨髓瘤細(xì)胞(OPM2、U266)外泌體與MM患者CD8~+T細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,MM患者CD8~+T細(xì)胞凋亡率在OPM2組(14.40±4.86%)和U266組(14.39±4.36%)低于與對照組(17.37±4.05%),但CD8~+T細(xì)胞凋亡率的下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、健康供者CD8~+T細(xì)胞存活率在OPM2組(112.63±3.88%,P=0.0099)和U266組(111.70±3.62%,P=0.0322)較對照組明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示骨髓瘤外泌體可促進(jìn)健康供者CD8~+T的增殖。MM患者CD8~+T細(xì)胞存活率在OPM2組(101.58±10.82%)和U266組(100.31±10.80%)較對照組變化不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、健康供者CD8~+T細(xì)胞穿孔素水平在OPM2外泌體組(10.82±2.53%)和U266外泌體組(9.34±2.36%,P=0.044)均低于對照組(12.76±3.31%),且U266組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;OPM2和U266兩組之間CD8~+T細(xì)胞穿孔素水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MM患者CD8~+T細(xì)胞穿孔素水平在OPM2外泌體(6.48±1.06%)和U266外泌體組(5.63±1.15%)較對照組(10.55±2.50%)均明顯減低(P=0.049,P=0.027),OPM2和U266兩組之間穿孔素水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、健康供者CD8~+T細(xì)胞顆粒酶B水平在OPM2組(31.87±6.10%)和U266組(32.99±7.08%)均較對照組(28.74±6.21%)稍有增高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MM患者CD8~+T細(xì)胞顆粒酶B水平在OPM2組(34.48%±9.98%)和U266組(41.49±9.17%)與對照組(34.91±8.14%)變化不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7、骨髓瘤細(xì)胞(OPM2、U266)外泌體與正常Treg細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,Treg細(xì)胞凋亡率在OPM2組(15.33±3.87%)和U266組(11.71±2.71%)均較對照組(19.61±3.50%)明顯降低(P=0.041,P=0.008),而OPM2和U266外泌體共培養(yǎng)兩組之間凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);骨髓瘤細(xì)胞(OPM2、U266)外泌體與MM患者Treg細(xì)胞共培養(yǎng)48h后,MM患者Treg細(xì)胞凋亡率在OPM2組(30.91±7.25%)和U266組(37.29±6.54%,P=0.023)高于與對照組(29.95±6.68%),且U266組Treg細(xì)胞凋亡率升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8、骨髓瘤外泌體與健康供者Treg細(xì)胞共培養(yǎng)48h,健康供者Treg細(xì)胞存活率在OPM2組(139.54±23.24%)和U266組(173.48±34.99%,P=0.043)均較無外泌體組升高,且U266組升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示骨髓瘤外泌體可促進(jìn)健康供者Treg的增殖。MM患者Treg與外泌體(OPM2或U266)共培養(yǎng)48h后,Treg存活率在OPM2組和U266組分別為82.29±12.16%和85.09±13.50%,其中與OPM2組Treg細(xì)胞增殖活性降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。9、健康供者Treg細(xì)胞IL-10水平在OPM2組(18.53±8.08pg/ml,P=0.043)和U266組(13.51±7.83pg/ml)較對照組(8.49±4.02pg/ml)升高,OPM2組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而OPM2和U266兩組之間IL-10水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。MM患者Treg細(xì)胞上清IL-10水平在OPM2組(3.29±1.84pg/ml)和U266組(2.60±1.72pg/ml)與對照組(1.39±1.02pg/ml)相比,有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10、健康供者Treg細(xì)胞TGF-β水平在OPM2組(417.57±19.33pg/ml)和U266組(325.96±14.32pg/ml)較對照組(386.60±28.89pg/ml)無明顯變化(P0.05)。MM患者Treg細(xì)胞上清TGF-β水平在OPM2組(290.29±23.21pg/ml,P=0.0046)和U266組(230.03±15.96pg/ml,P=0.0068)較對照組(387.49±21.60pg/ml)均明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。11、健康供者CD4~+和CD8~+T細(xì)胞與OPM2外泌體共培養(yǎng)后,lncRNA H19表達(dá)水平在共培養(yǎng)組(2~(1.52±1.99))較對照組(2~(0.00±2.2))升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。第二部分lncRNA H19參與多發(fā)性骨髓瘤硼替佐米耐藥的作用研究1、血漿中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)水平以中位數(shù)(四分位距)表示,在MM患者初診組、緩解組、難治復(fù)發(fā)組和健康對照組分別為4.1740(10.07)、3.3784(6.22)、12.8723(38.1)、1.0867(1.48),四組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。其中難治復(fù)發(fā)組顯著高于初診組(P=0.005)、緩解組(P0.001)和健康對照組(P0.001),初診組高于健康對照組(P=0.048),初診組與緩解組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.174)。2、檢測MM患者血漿外泌體中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)水平,MM初診組、緩解組和難治復(fù)發(fā)組患者的相對表達(dá)量分別為0.7071(1.42)、2.8481(6.80)、9.5137(23.38)。三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004),采用方差分析進(jìn)行組間兩兩比較,lncRNA H19表達(dá)水平難治復(fù)發(fā)組顯著高于初診組(P=0.015)、緩解組(P=0.014),初診組與緩解組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.692)。3、MM患者骨髓CD138~+瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)水平與自身血漿中l(wèi)ncRNA H19水平呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.745,P0.001;Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.639,P=0.002)。4、骨髓瘤OPM2、LP1和U266敏感株硼替佐米的IC50值分別為22.85nM,7.22nM和4.25nM,其相應(yīng)lncRNA H19的相對表達(dá)量分別為2~(0.31±1.85)、2~(-6.74±0.49)、2~(-9.12±2.00),提示硼替佐米的敏感性可能與lncRNA H19相關(guān)。5、通過硼替佐米耐藥細(xì)胞系的培養(yǎng),三種耐藥細(xì)胞系在硼替佐米加藥后存活率較敏感細(xì)胞明顯升高,凋亡率(U266、LP1)明顯降低。耐藥OPM2、U266和LP1硼替佐米的IC50值分別為82.91nM,370nM和84.65nM,與各自敏感細(xì)胞IC50值對比,耐藥倍數(shù)分別為3.63倍,87.06倍和11.72倍,其中U266耐藥倍數(shù)最高。6、耐藥OPM2、U266和LP1細(xì)胞lncRNA H19水平分別為2~(3.8795±0.5064)、2~(1.7595±0.3154)、2~(2.6429±0.8559),均較相應(yīng)敏感細(xì)胞系升高,其中U266和LP1細(xì)胞系在耐藥株有明顯升高,P值分別為0.037和0.010。提示lncRNA H19與MM細(xì)胞系硼替佐米耐藥的發(fā)生有關(guān)。7、通過慢病毒轉(zhuǎn)染,在OPM2和U266細(xì)胞系中過表達(dá)lncRNA H19,過表達(dá)倍數(shù)分別為1858倍和3,070,410倍。采用CCK8方法檢測過表達(dá)lncRNA H19的OPM2細(xì)胞系存活率,體外加入硼替佐米藥物濃度分別為10nM、20nM、40nM、80nM和160nM。48h后,過表達(dá)lncRNA H19的OPM2細(xì)胞系的存活率(%)分別為100.50±14.85,83.04±11.24,77.51±15.75,73.00±3.47,70.88±10.71;空白轉(zhuǎn)染OPM2細(xì)胞系存活率(%)分別為88.00±8.20,80.22±6.08,72.89±8.50,59.74±13.89,51.83±8.71,OPM2對照組存活率(%)分別為83.01±2.84,54.66±7.61,18.41±3.79,11.69±2.16,7.87±0.93。其中OPM2過表達(dá)lncRNA H19后,OPM2-H19轉(zhuǎn)染組在硼替佐米20nM、40nM、80nM和160nM濃度下,存活率均高于對照組,P值分別為0.007、0.040、0.001、0.001,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示OPM2-H19轉(zhuǎn)染細(xì)胞對硼替佐米藥物的敏感性降低。8、WB顯示AKT、pAKT和NF-κB在U266敏感細(xì)胞系硼替佐米給藥組較不給藥組,均明顯受到抑制;而U266耐藥株在加藥組較不加藥組,AKT、pAKT抑制不明顯;U266耐藥株的NF-κB幾乎不能表達(dá),提示與硼替佐米敏感株不同,NF-κB在硼替佐米耐藥機(jī)制中可能并不發(fā)揮主要作用。9、qPCR檢測發(fā)現(xiàn),MM細(xì)胞系MDR1水平與lncRNA H19水平呈正相關(guān)關(guān)系,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.546,P=0.035);MM細(xì)胞系TRX水平與lncRNA H19水平可能存在相關(guān)性(r=0.513,P=0.051)。結(jié)論:1、骨髓瘤細(xì)胞外泌體可以促進(jìn)正常CD4~+T細(xì)胞凋亡、抑制增殖,抑制正常CD8~+T凋亡、促進(jìn)增殖,但抑制穿孔素分泌。骨髓瘤細(xì)胞外泌體抑制正常Treg凋亡、促進(jìn)增殖,并促進(jìn)IL-10分泌。提示骨髓瘤外泌體可作為抗原刺激,促進(jìn)CD8~+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞增殖,但抑制正常T細(xì)胞的免疫功能。骨髓瘤細(xì)胞外泌體可導(dǎo)致T細(xì)胞lncRNA H19表達(dá)增高,提示T細(xì)胞的免疫功能改變可能與lncRNA H19相關(guān)。2.多發(fā)性骨髓瘤患者的血漿lncRNA H19水平較健康供者顯著升高,并且在多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)難治組患者較初治組和緩解組均明顯升高,表明lncRNA H19與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。多發(fā)性骨髓瘤患者血漿lncRNA H19水平與血漿外泌體中及骨髓CD138~+漿細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19水平呈正相關(guān),提示血漿中的lncRNA H19來源于骨髓中的惡性漿細(xì)胞,并且可以通過外泌體釋放進(jìn)入血漿中。3.多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(OPM2、U266、LP1)lncRNA H19水平與硼替佐米藥物敏感性相關(guān),lncRNA H19高表達(dá)的細(xì)胞,硼替佐米的IC50值更高,提示lncRNA H19與硼替佐米耐藥有關(guān)。通過增加硼替佐米藥物濃度培養(yǎng),建立耐藥細(xì)胞系(U266),發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞系較敏感細(xì)胞系lncRNA H19顯著升高,在藥物作用下,耐藥細(xì)胞較敏感細(xì)胞凋亡率明顯降低、細(xì)胞增殖活性明顯升高。提示lncRNA H19與多發(fā)性骨髓瘤耐藥相關(guān),耐藥機(jī)制可能與MDR1、NF-κB及PI3K/Akt通路相關(guān)。
【圖文】：

6圖 2 lncRNAH19 的作用機(jī)制（摘自 Regulation of Human Breast Cancer bthe Long Non-Coding RNA H19, Int J Mol Sci. 2017 Nov 3;18(11)）研究目的、方法第一部分：研究主要探討多發(fā)性骨髓瘤源性外泌體對 T 細(xì)胞（CD4+T 細(xì)CD8+T 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞）免疫的作用，，從 T 細(xì)胞凋亡、增殖及功能的變化步探索骨髓瘤外泌體對 T 細(xì)胞免疫的影響，進(jìn)一步闡明外泌體在骨髓瘤發(fā)展中的機(jī)制，為骨髓瘤的治療提供理論依據(jù)。本部分實(shí)驗(yàn)共分兩部分：一、骨髓瘤外泌體的提取及鑒定：采用超速離心法和外泌體提取試劑盒進(jìn)髓瘤細(xì)胞外泌體的提取，并應(yīng)用透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)。二、骨髓瘤外泌體對 T 細(xì)胞功能的影響：磁珠分選 CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)

透射電鏡觀察骨髓瘤細(xì)胞系外泌體（超速離心法）
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡國文;李青;牛鑫;胡斌;劉鵑;沈曉黎;汪泱;鄧志鋒;;旋轉(zhuǎn)超濾:一種提取細(xì)胞外泌體的新方法[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年06期

本文編號：2595511