【摘要】：目的背景:胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma,PDAC)在人群中發(fā)病率和死亡率逐年升高。目前針對(duì)該腫瘤的治療方法較為局限,藥物治療效果不佳,尚無(wú)突破性進(jìn)展。顯著的間質(zhì)纖維化是PDAC特征性組織學(xué)表現(xiàn),構(gòu)成微環(huán)境物理屏障,阻礙藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞。緩解PDAC間質(zhì)纖維化能破壞該物理屏障,從而提升藥物治療有效率。PDAC中活化的胰腺星形細(xì)胞(Pancreatic stellate cells,PSCs)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix,ECM),參與間質(zhì)纖維化的形成。另外,腫瘤與腫瘤微環(huán)境互相依存和促進(jìn),同時(shí)也互相限制和拮抗。腫瘤微環(huán)境可通過分泌、代謝、免疫等途徑影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。PSCs作為PDAC微環(huán)境中的主要成分,具有強(qiáng)大的分泌功能,對(duì)PCCs生長(zhǎng)的影響不容忽視。Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在肝臟星形細(xì)胞和乳腺成纖維細(xì)胞活化過程中有重要的調(diào)控作用,但對(duì)PSCs的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究YAP1對(duì)PSCs活化水平和旁分泌的調(diào)控作用及潛在作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:原代PSCs由新鮮手術(shù)切除的PDAC組織經(jīng)體外培養(yǎng)獲得,利用全反式維甲酸(All-transretinoicacid,ATRA)處理PSCs使其去活化。通過油紅O染色及α平滑肌肌動(dòng)蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)免疫熒光染色驗(yàn)證PSCs活化水平的改變。通過Western Blot和免疫熒光染色分別檢測(cè)YAP1在對(duì)照組和ATRA處理組PSCs中的表達(dá)。利用YAP1小干擾RNA或YAP1抑制劑維替泊芬(Verteporfin,VP)抑制YAP1表達(dá),并通過Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PSCs活化表型α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平。利用YAP1小干擾RNA抑制YAP1表達(dá),在倒置顯微鏡下觀察PSCs的形態(tài)變化,分別利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)、膠原收縮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞收縮能力的改變。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR芯片篩選受YAP1調(diào)控的ECM基因,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot和ELISA在三株P(guān)SCs中驗(yàn)證其表達(dá)和分泌。利用亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfite sequencing,BSP)、生物信息學(xué)分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation,CHIP)和熒光素酶報(bào)告基因探索YAP1對(duì)此ECM基因的調(diào)控機(jī)制。利用PSCs條件培養(yǎng)基及transwell小室共培養(yǎng)系統(tǒng)研究PSCs旁分泌對(duì)PCCs增殖能力的影響。通過制作PDAC組織芯片(Tissuemicroarrays,TMA)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)染色來(lái)評(píng)價(jià)YAP1和篩選出的細(xì)胞外因子在PDAC組織間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平,并分析其表達(dá)水平與臨床病理特征之間關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:PDAC組織培養(yǎng)5天后分離出PSCs,PSCs呈長(zhǎng)梭形,有鋒芒狀突起,油紅O染色呈陰性,α-SMA免疫熒光染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。PSCs經(jīng)ATRA處理后形態(tài)變?yōu)榘秩切?油紅O染色呈陽(yáng)性,α-SMA免疫熒光染色呈弱陽(yáng)性。Western Blot和免疫熒光染色結(jié)果均顯示,與對(duì)照組相比,YAP1在ATRA處理組PSCs胞核中表達(dá)水平明顯更低。抑制PSCs中YAP1的表達(dá)可下調(diào)α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá),改變梭形細(xì)胞形態(tài),降低細(xì)胞的增殖能力,使細(xì)胞周期停滯在G2期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞收縮能力。PCR芯片結(jié)果分析顯示,受YAP1調(diào)控最顯著的ECM基因之一是富含半胱氨酸酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and cysteine rich,SPARC)(倍數(shù)變化為 13.3)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、Western Blot和ELISA結(jié)果顯示,敲低YAP1導(dǎo)致SPARC的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)及分泌減少;過表達(dá)YAP1導(dǎo)致SPARC的mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)及分泌增多。BSP檢測(cè)結(jié)果顯示敲低YAP1對(duì)PSCs中SPARC啟動(dòng)子甲基化水平?jīng)]有影響。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子RUNX1可能介導(dǎo)YAP1對(duì)SPARC的調(diào)控作用。Co-IP實(shí)驗(yàn)證明YAP1蛋白和轉(zhuǎn)錄因子RUNX1之間存在相互作用。Western Blot結(jié)果顯示敲低YAP1能上調(diào)RUNX1的表達(dá)。CHIP、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及Western Blot證明RUNX1通過結(jié)合SPARC啟動(dòng)子來(lái)抑制SPARC的表達(dá)。取敲低YAP1的PSCs條件培養(yǎng)基孵育PCCs將促進(jìn)其增殖,在此基礎(chǔ)上過表達(dá)PSCs的SPARC將抑制這種促進(jìn)作用。取過表達(dá)YAP1的PSCs條件培養(yǎng)基孵育PCCs將抑制其增殖,在此基礎(chǔ)上敲低PSCs的SPARC將解除這種抑制作用。小室共培養(yǎng)的結(jié)果與之一致�；贗HC分析,YAP1和SPARC蛋白在PDAC組織間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P0.05)。PDAC間質(zhì)細(xì)胞中YAP1與SPARC的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.433,P0.001)。PDAC間質(zhì)細(xì)胞中YAP1的表達(dá)水平與間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系(r = 0.543,P0.001)。間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)水平的SPARC是PDAC總生存期的獨(dú)立不良預(yù)后因素(HR = 3.216,P=0.005)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:YAP1在活化的PSCs中表達(dá)水平高,且抑制YAP1的表達(dá)能使PSCs去活化。在PSCs中,YAP1通過RUNX1的介導(dǎo)正性調(diào)控SPARC蛋白的表達(dá)及分泌�；罨腜SCs通過旁分泌SPARC抑制PCCs的增殖。本研究為緩解PDAC間質(zhì)纖維化提供新的治療思路,并從旁分泌的角度分析了 PSCs-PCCs之間的關(guān)系,進(jìn)一步闡釋了腫瘤微環(huán)境的變化對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
【圖文】：

圖１：原代培養(yǎng)ＰＳＣｓ的鏡下形態(tài)逡逑Ａ，用于原代培養(yǎng)的ＰＤＡＣ組織塊及周圍剛爬出的ＰＳＣｓ。Ｂ，培養(yǎng)２－３周后ＰＳＣｓ。（顯微鏡放大倍數(shù)：ｘ４0）逡逑表１：邋３例ＰＤＡＣ患者臨床病理資料樣本性別年齡（歲）分化程度大�。ǎ悖恚╁逦恢缅澹裕危头制阱义希＃边娔羞姡叮催姼哌姡保颠娨阮^邐Ｔ１Ｎ２Ｍ１逡逑＃２邐女邐６８邐低邐２．５邐胰體、尾Ｔ２Ｎ１Ｍ０逡逑

邐中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研究生學(xué)位論文邐逡逑３、ＹＡＰ邋１在不同活化水平ＰＳＣｓ中的表達(dá)情況逡逑為了比較ＹＡＰ１在不同活化水平ＰＳＣｓ中的表達(dá)情況，我們利用ＡＴＲＡ處理逡逑ＰＳＣｓ使其去活化，通過Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ及免疫熒光染色對(duì)ＹＡＰ１在三株ＰＳＣｓ中的逡逑表達(dá)及分布情況進(jìn)行檢測(cè)。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ結(jié)果發(fā)現(xiàn)在ＡＴＲＡ處理組細(xì)胞核蛋白中，逡逑ＹＡＰ１的表達(dá)水平較對(duì)照組低（圖３Ａ）；在ＡＴＲＡ處理組細(xì)胞漿蛋白中，，ＹＡＰ１的逡逑表達(dá)水平較對(duì)照組高（圖３Ａ）。免疫熒光染色結(jié)果也觀察到ＹＡＰ１免疫熒光染色逡逑強(qiáng)度在ＡＴＲＡ處理組的ＰＳＣｓ胞核中比對(duì)照組更弱（圖３Ｂ）。以上結(jié)果說明在逡逑ＡＴＲＡ誘導(dǎo)ＰＳＣｓ去活化后，ＹＡＰ１蛋白發(fā)生轉(zhuǎn)位，在細(xì)胞核中表達(dá)減少。逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.9

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本文編號(hào)：2594371