【摘要】：研究目的腫瘤免疫治療在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。特別是近年來(lái)靶向T細(xì)胞的治療,特別是CART在于血液腫瘤治療上取得的進(jìn)展,引起人們的廣泛關(guān)注。但是由于T細(xì)胞的遷移能力弱,故CART對(duì)實(shí)體腫瘤的治療效果有限。腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫細(xì)胞,其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)是腫瘤微環(huán)境的主要免疫細(xì)胞,TAM不僅具有直接的抗腫瘤作用,而且在啟動(dòng)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫中起關(guān)鍵作用。然而,大量的研究結(jié)果證實(shí),腫瘤(如,肝細(xì)胞肝癌)局部的TAM呈現(xiàn)M2樣表型,具有促進(jìn)腫瘤的作用。因此,新一代免疫腫瘤藥物靶向TAM以獲得更有效的治療癌癥的有效應(yīng)答策略。另外,巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力,通過(guò)改造巨噬細(xì)胞將成為實(shí)體腫瘤免疫細(xì)胞治療的新策略。Pdcd4(程序性細(xì)胞死亡4)是一種新型腫瘤抑制基因,已報(bào)道通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期、細(xì)胞自噬和細(xì)胞增殖來(lái)抑制腫瘤發(fā)生。然而,我們和其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)PDCD4也參入免疫細(xì)胞功能的調(diào)控。我們的前期研究顯示PDCD4可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞炎性因子,抑制炎癥相關(guān)的腫瘤(結(jié)腸癌);Pdcd4缺乏還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞脂自噬并減輕巨噬細(xì)胞泡沫化形成,抑制動(dòng)脈粥樣硬化;另一項(xiàng)研究表明Pdcd4調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞替代性激活和抗原誘導(dǎo)的肺部炎癥中氣道重塑的標(biāo)志物。這些結(jié)果提示PDCD4參與巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控。然而,PDCD4表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用有何影響?是促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)還是抑制腫瘤的生長(zhǎng)?如果有影響,可能的機(jī)制是什么?這些問(wèn)題尚不清楚。本課題以PDCD4敲除的巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞肝癌為模型,在體內(nèi)外研究了 PDCD4敲除的巨噬細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng),并從巨噬細(xì)胞M1和M2極化入手,探索了其作用機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)了 PDCD4敲除的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng),其主要機(jī)制是PDCD4缺失抑制腫瘤微環(huán)境對(duì)M2巨噬細(xì)胞表型的誘導(dǎo)分化。為以Pdcd4敲除巨噬細(xì)胞治療腫瘤奠定研究方法1.體外研究PDCD4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用的影響(1)分別從6-8周齡WT和Pdcd4敲除基因小鼠取骨髓細(xì)胞,利用M-CSF細(xì)胞因子誘導(dǎo)獲得骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(BMDM)(2)BMDM巨噬細(xì)胞與小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間(24、48和72小時(shí))(3)用MTT法測(cè)定巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(4)使用ANOVA統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)2.小鼠體內(nèi)研究PDCD4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用的影響(1)分別將來(lái)自野生型和PDCD4-/-小鼠的BMDMs(4×106)與H22細(xì)胞(1X107)混合(2)分別注射到BALBc小鼠的左右后腿,每隔3天測(cè)量腫瘤的大小,繪制生長(zhǎng)曲線(3)16天后處死小鼠并收集腫瘤,稱重(4)腫瘤浸入甲醛中固定并制備病理切片,HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢查3.在M1和M2極化的條件下,研究PDCD4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響(1)分別從6-8周齡WT和Pdcd4敲除基因小鼠取腹腔巨噬細(xì)胞(PM)(2)用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1分化;用IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2分化(3)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA方法檢測(cè)M1和M2表型標(biāo)志分子和細(xì)胞因子的表達(dá)4.在腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境下,體外研究PDCD4缺失對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型的影響(1)分別用WT和Pdcd4敲除基因小鼠骨髓細(xì)胞,利用M-CSF細(xì)胞因子誘導(dǎo)獲得BMDM(2)將Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)的上清液分別加入培養(yǎng)的WT巨噬細(xì)胞和PDCD4-/-巨噬細(xì)胞(3)24小時(shí)、48小時(shí)后收集細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA方法檢測(cè)M1和M2表型標(biāo)志分子和細(xì)胞因子的表達(dá)5.PDCD4缺失對(duì)小鼠皮下腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞表型的影響(1)分別將來(lái)自野生型和PDCD4-/-小鼠的BMDMs(4×106)與H22細(xì)胞(1×1o7)混合(2)分別注射到BALBc小鼠的左右后腿。(3)16天后處死小鼠、收集腫瘤,分離單個(gè)細(xì)胞(4)用流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞M2群體表型結(jié)果1.體外實(shí)驗(yàn)顯示Pdcd4缺失促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用為了研究PDCD4對(duì)巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用的影響,我們分別從WT和PDCD4-/-小鼠獲得BMDM,與小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間,然后用CCK8法測(cè)定腫瘤的生長(zhǎng)狀況,結(jié)果顯示PDCD4-/-的巨噬細(xì)胞能更有效的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。2.小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)證明Pdcd4缺失增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用為了進(jìn)一步在體內(nèi)證明Pdcd4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用的影響,我們把BMDM與H22肝癌細(xì)胞混合,注射到小鼠皮下。為了排除小鼠的個(gè)體差異,每只小鼠一側(cè)為WT組,另一側(cè)和PDCD4-/-組。結(jié)果顯示單獨(dú)H22組腫瘤生長(zhǎng)很快,WT巨噬細(xì)胞具有抑制腫瘤的作用,然而,Pdcd4-/-巨噬細(xì)胞抗腫瘤作用更強(qiáng),并且病理學(xué)檢測(cè)顯示Pdcd4-/-組的腫瘤組織中壞死的面積更大。說(shuō)明PDCD4缺失促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用。3.M1和M2極化的條件下,Pdcd4缺失抑制M2極化而促進(jìn)M1的極化已知M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤的作用,M2型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用,為了探索Pdcd4缺失增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗腫瘤的機(jī)制,我們首先在M1和M2極化的條件下,研究了 Pdcd4缺失對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示Pdcd4缺失上調(diào)M1巨噬細(xì)胞IL-6的表達(dá),但對(duì)ICOS和TNF-α等其他M1表達(dá)沒(méi)有明顯影響。然而,Pdcd4缺失明顯抑制M2的表型(如,Arg-1,CD206,IL-10),提示PDCD4缺失抑制M2、促進(jìn)M1的極化。4.在腫瘤培養(yǎng)上清液存在的條件下,Pdcd4缺失抑制巨噬細(xì)胞向M2分化由于我們發(fā)現(xiàn)Pdcd4巨噬細(xì)胞與Hepa1-6細(xì)胞共培養(yǎng),可顯著抑制Hepa1-6細(xì)胞的體外增殖。故我們推測(cè)在共培養(yǎng)的微環(huán)境中,Pdcd4的缺失也可能影響巨噬細(xì)胞的極化。我們將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液加到巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24h和48h后,用qRT-PCR和ELISA檢測(cè)M1和M2的表型分子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤培養(yǎng)上清存在條件下,Pdcd4缺失的巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平IL-6等M1表型,而抑制Arg-1、CD206、IL-10和TGF-β等M2表型,并且對(duì)M2表型的抑制更明顯。說(shuō)明在腫瘤培養(yǎng)上清液存在的條件下,Pdcd4缺失抑制巨噬細(xì)胞向M2分化,這可能是Pdcd4缺失增強(qiáng)其抗腫瘤作用的機(jī)制之一。5.在小鼠肝癌移植瘤模型中,Pdcd4缺失的巨噬細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞對(duì)其向M2的誘導(dǎo)分別取小鼠皮下移植的H22腫瘤組織,分離單個(gè)細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的表型,結(jié)果顯示H22與WT巨噬細(xì)胞接種的腫瘤組織中巨噬細(xì)胞有高水平M2標(biāo)志(F4/80 + CD206 +),但H22與Pdcd4缺失型巨噬細(xì)胞接種的腫瘤組織中M2巨噬細(xì)胞很少。說(shuō)明在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)野生型巨噬細(xì)胞向M2分化,進(jìn)而有利于腫瘤的生長(zhǎng),但Pdcd4缺失的巨噬細(xì)胞可抵抗其向M2極化,更有利于其抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮。結(jié)論1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明Pdcd4缺失的巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用,可能成為新的抗腫瘤的免疫細(xì)胞,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值2.已知M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤的作用,M2型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用。我們發(fā)現(xiàn)Pdcd4缺失抑制巨噬細(xì)胞向M2分化,促進(jìn)其向M1分化,這可能是Pdcd4缺失增強(qiáng)其抗腫瘤作用的機(jī)制之一。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2594109