【摘要】：研究目的腫瘤免疫治療在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。特別是近年來靶向T細胞的治療,特別是CART在于血液腫瘤治療上取得的進展,引起人們的廣泛關(guān)注。但是由于T細胞的遷移能力弱,故CART對實體腫瘤的治療效果有限。腫瘤微環(huán)境中存在大量的免疫細胞,其中腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)是腫瘤微環(huán)境的主要免疫細胞,TAM不僅具有直接的抗腫瘤作用,而且在啟動特異性細胞免疫和體液免疫中起關(guān)鍵作用。然而,大量的研究結(jié)果證實,腫瘤(如,肝細胞肝癌)局部的TAM呈現(xiàn)M2樣表型,具有促進腫瘤的作用。因此,新一代免疫腫瘤藥物靶向TAM以獲得更有效的治療癌癥的有效應(yīng)答策略。另外,巨噬細胞具有很強的遷移能力,通過改造巨噬細胞將成為實體腫瘤免疫細胞治療的新策略。Pdcd4(程序性細胞死亡4)是一種新型腫瘤抑制基因,已報道通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞凋亡,細胞周期、細胞自噬和細胞增殖來抑制腫瘤發(fā)生。然而,我們和其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)PDCD4也參入免疫細胞功能的調(diào)控。我們的前期研究顯示PDCD4可通過抑制巨噬細胞炎性因子,抑制炎癥相關(guān)的腫瘤(結(jié)腸癌);Pdcd4缺乏還可增強巨噬細胞脂自噬并減輕巨噬細胞泡沫化形成,抑制動脈粥樣硬化;另一項研究表明Pdcd4調(diào)節(jié)巨噬細胞替代性激活和抗原誘導(dǎo)的肺部炎癥中氣道重塑的標志物。這些結(jié)果提示PDCD4參與巨噬細胞功能的調(diào)控。然而,PDCD4表達對巨噬細胞抗腫瘤作用有何影響?是促進腫瘤的生長還是抑制腫瘤的生長?如果有影響,可能的機制是什么?這些問題尚不清楚。本課題以PDCD4敲除的巨噬細胞和肝細胞肝癌為模型,在體內(nèi)外研究了 PDCD4敲除的巨噬細胞的抗腫瘤效應(yīng),并從巨噬細胞M1和M2極化入手,探索了其作用機制。我們發(fā)現(xiàn)了 PDCD4敲除的巨噬細胞表現(xiàn)出更強的抗腫瘤效應(yīng),其主要機制是PDCD4缺失抑制腫瘤微環(huán)境對M2巨噬細胞表型的誘導(dǎo)分化。為以Pdcd4敲除巨噬細胞治療腫瘤奠定研究方法1.體外研究PDCD4缺失對巨噬細胞抗腫瘤作用的影響(1)分別從6-8周齡WT和Pdcd4敲除基因小鼠取骨髓細胞,利用M-CSF細胞因子誘導(dǎo)獲得骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)(2)BMDM巨噬細胞與小鼠肝癌細胞系Hepa1-6細胞共培養(yǎng)不同時間(24、48和72小時)(3)用MTT法測定巨噬細胞對腫瘤細胞生長的影響(4)使用ANOVA統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)2.小鼠體內(nèi)研究PDCD4缺失對巨噬細胞抗腫瘤作用的影響(1)分別將來自野生型和PDCD4-/-小鼠的BMDMs(4×106)與H22細胞(1X107)混合(2)分別注射到BALBc小鼠的左右后腿,每隔3天測量腫瘤的大小,繪制生長曲線(3)16天后處死小鼠并收集腫瘤,稱重(4)腫瘤浸入甲醛中固定并制備病理切片,HE染色進行病理學(xué)檢查3.在M1和M2極化的條件下,研究PDCD4缺失對巨噬細胞極化的影響(1)分別從6-8周齡WT和Pdcd4敲除基因小鼠取腹腔巨噬細胞(PM)(2)用LPS誘導(dǎo)巨噬細胞向M1分化;用IL-4誘導(dǎo)巨噬細胞向M2分化(3)用實時熒光定量PCR和ELISA方法檢測M1和M2表型標志分子和細胞因子的表達4.在腫瘤生長的微環(huán)境下,體外研究PDCD4缺失對腫瘤相關(guān)巨噬細胞表型的影響(1)分別用WT和Pdcd4敲除基因小鼠骨髓細胞,利用M-CSF細胞因子誘導(dǎo)獲得BMDM(2)將Hepa1-6細胞培養(yǎng)的上清液分別加入培養(yǎng)的WT巨噬細胞和PDCD4-/-巨噬細胞(3)24小時、48小時后收集細胞,用實時熒光定量PCR和ELISA方法檢測M1和M2表型標志分子和細胞因子的表達5.PDCD4缺失對小鼠皮下腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞表型的影響(1)分別將來自野生型和PDCD4-/-小鼠的BMDMs(4×106)與H22細胞(1×1o7)混合(2)分別注射到BALBc小鼠的左右后腿。(3)16天后處死小鼠、收集腫瘤,分離單個細胞(4)用流式細胞術(shù)分析巨噬細胞M2群體表型結(jié)果1.體外實驗顯示Pdcd4缺失促進巨噬細胞的抗腫瘤作用為了研究PDCD4對巨噬細胞抗腫瘤作用的影響,我們分別從WT和PDCD4-/-小鼠獲得BMDM,與小鼠肝癌細胞系Hepa1-6細胞共培養(yǎng)不同時間,然后用CCK8法測定腫瘤的生長狀況,結(jié)果顯示PDCD4-/-的巨噬細胞能更有效的抑制腫瘤細胞的生長。2.小鼠移植瘤實驗證明Pdcd4缺失增強巨噬細胞抗腫瘤作用為了進一步在體內(nèi)證明Pdcd4缺失對巨噬細胞抗腫瘤作用的影響,我們把BMDM與H22肝癌細胞混合,注射到小鼠皮下。為了排除小鼠的個體差異,每只小鼠一側(cè)為WT組,另一側(cè)和PDCD4-/-組。結(jié)果顯示單獨H22組腫瘤生長很快,WT巨噬細胞具有抑制腫瘤的作用,然而,Pdcd4-/-巨噬細胞抗腫瘤作用更強,并且病理學(xué)檢測顯示Pdcd4-/-組的腫瘤組織中壞死的面積更大。說明PDCD4缺失促進巨噬細胞的抗腫瘤作用。3.M1和M2極化的條件下,Pdcd4缺失抑制M2極化而促進M1的極化已知M1型巨噬細胞具有抗腫瘤的作用,M2型巨噬細胞具有促進腫瘤生長的作用,為了探索Pdcd4缺失增強巨噬細胞抗腫瘤的機制,我們首先在M1和M2極化的條件下,研究了 Pdcd4缺失對巨噬細胞極化的影響。結(jié)果顯示Pdcd4缺失上調(diào)M1巨噬細胞IL-6的表達,但對ICOS和TNF-α等其他M1表達沒有明顯影響。然而,Pdcd4缺失明顯抑制M2的表型(如,Arg-1,CD206,IL-10),提示PDCD4缺失抑制M2、促進M1的極化。4.在腫瘤培養(yǎng)上清液存在的條件下,Pdcd4缺失抑制巨噬細胞向M2分化由于我們發(fā)現(xiàn)Pdcd4巨噬細胞與Hepa1-6細胞共培養(yǎng),可顯著抑制Hepa1-6細胞的體外增殖。故我們推測在共培養(yǎng)的微環(huán)境中,Pdcd4的缺失也可能影響巨噬細胞的極化。我們將腫瘤細胞培養(yǎng)的上清液加到巨噬細胞的培養(yǎng)液中,培養(yǎng)24h和48h后,用qRT-PCR和ELISA檢測M1和M2的表型分子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腫瘤培養(yǎng)上清存在條件下,Pdcd4缺失的巨噬細胞表達高水平IL-6等M1表型,而抑制Arg-1、CD206、IL-10和TGF-β等M2表型,并且對M2表型的抑制更明顯。說明在腫瘤培養(yǎng)上清液存在的條件下,Pdcd4缺失抑制巨噬細胞向M2分化,這可能是Pdcd4缺失增強其抗腫瘤作用的機制之一。5.在小鼠肝癌移植瘤模型中,Pdcd4缺失的巨噬細胞抵抗腫瘤細胞對其向M2的誘導(dǎo)分別取小鼠皮下移植的H22腫瘤組織,分離單個細胞,用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境的表型,結(jié)果顯示H22與WT巨噬細胞接種的腫瘤組織中巨噬細胞有高水平M2標志(F4/80 + CD206 +),但H22與Pdcd4缺失型巨噬細胞接種的腫瘤組織中M2巨噬細胞很少。說明在腫瘤的生長過程中腫瘤細胞可誘導(dǎo)野生型巨噬細胞向M2分化,進而有利于腫瘤的生長,但Pdcd4缺失的巨噬細胞可抵抗其向M2極化,更有利于其抗腫瘤效應(yīng)的發(fā)揮。結(jié)論1.體內(nèi)外實驗證明Pdcd4缺失的巨噬細胞具有更強的抗腫瘤作用,可能成為新的抗腫瘤的免疫細胞,具有潛在的應(yīng)用價值2.已知M1型巨噬細胞具有抗腫瘤的作用,M2型巨噬細胞具有促進腫瘤生長的作用。我們發(fā)現(xiàn)Pdcd4缺失抑制巨噬細胞向M2分化,促進其向M1分化,這可能是Pdcd4缺失增強其抗腫瘤作用的機制之一。
【圖文】：

i口G，3e(VW}1IL-3TA6He口口2
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;Bioinformatics analysis of metastasis-related proteins in hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2008年38期

2 ;Involvement of extracellular signal-regulated kinase/mitogenactivated protein kinase pathway in multidrug resistance induced by HBx in hepatoma cell line[J];World Journal of Gastroenterology;2004年23期

3 ;Effects of p53 on apoptosis and proliferation of hepatocellular cardnoma cells heated with transcatheter arterial chemoembolization[J];World Journal of Gastroenterology;2004年02期

，

本文編號：2594109