發(fā)布時(shí)間：2020-03-20 19:50

【摘要】：Copine-3蛋白是由CPNE3基因編碼的鈣離子依賴性蛋白,是copines蛋白家族成員之一。該蛋白家族成員進(jìn)化高度保守,功能多樣,但是具體作用機(jī)理尚未明確。研究表明,copine-3蛋白與腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展具有相關(guān)性,其在生物體內(nèi),特別是腫瘤細(xì)胞中可能承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能。本研究首先通過western-blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry,IHC)發(fā)現(xiàn)copine-3蛋白在肺腺癌細(xì)胞系和肺腺癌患者癌組臨床樣品中都廣泛表達(dá),并且IHC表明copine-3蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,也有細(xì)胞核定位現(xiàn)象。將pEGFP-N1/CPNE3真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染293T和H1299細(xì)胞,通過western-blot檢測(cè)細(xì)胞亞組份和激光共聚焦觀察表明copine-3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。然后,在肺腺癌A549細(xì)胞中,我們通過小干擾RNA(Small interfering RNA;siRNA)靶向干擾 CPNE3 基因表達(dá)后,Transwell實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)(p0.01)。利用基于細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),鑒定了 51個(gè)在A549細(xì)胞中siRNA介導(dǎo)CPNE3基因沉默后表達(dá)發(fā)生變化的蛋白質(zhì)。其中,SQSTMl/p62(由SQSTM1基因編碼)是CPNE3基因沉默后顯著下調(diào)的蛋白質(zhì),通過RNA干擾技術(shù),在A549細(xì)胞中干擾SQSTM1基因促進(jìn)了細(xì)胞的遷移,western-blot檢測(cè)顯示,上皮型鈣黏附蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào),波形蛋白Vimentin表達(dá)上調(diào)。這表明,CPNE3基因沉默后,通過下調(diào)SQSTM1/p62表達(dá),促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生,從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。同時(shí),為進(jìn)一步探討copine-3的功能,我們利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA在肺腺癌A549、H1299和SPC-A1細(xì)胞株中,穩(wěn)定沉默了CPNE3基因的表達(dá)。平板克隆和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,穩(wěn)定沉默CPNE3基因能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖。此外,我們還成功構(gòu)建了人支氣管上皮細(xì)胞 HBE(human bronchial epithelial cells,HBE)細(xì)胞的CPNE3基因過表達(dá)細(xì)胞株,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CPNE3基因的過表達(dá)能夠抑制HBE細(xì)胞的增殖。利用基于SILAC的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),我們鑒定了在A549中穩(wěn)定沉默CPNE3基因后的差異表達(dá)蛋白質(zhì),共獲得差異表達(dá)總蛋白質(zhì)59個(gè),差異核蛋白209個(gè)。最后,對(duì)通過SILAC技術(shù)獲得的在A549細(xì)胞中siRNA干擾和穩(wěn)定沉默CPNE3基因后的差異蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。Gene Ontology分析和KEGG Pathway富集,顯示這些差異蛋白參與多個(gè)生物學(xué)過程和通路。同時(shí)也完成了差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析,為后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)驗(yàn)研究提供了線索,為進(jìn)一步探究copine-3蛋白的生物學(xué)功能,闡明copine-3蛋白調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移和增殖機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。
【圖文】：

芯片置于蘇木素染液中，輕度復(fù)染５邋ｍｉｎ，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染水沖洗１０邋ｍｉｎ返藍(lán)。逡逑酒精分化ｌ0ｓ，自來水沖洗５邋ｍｉｎ。鹽酸酒精：向７５％乙醇中與透明：將組織芯片置于７５％，８５％，９５％，邋１００％各級(jí)酒精中封片，顯微鏡觀察。逡逑蛋白在各肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)逡逑胞系的遺傳背景不同，細(xì)胞中一些蛋白的表達(dá)量也會(huì)有所差異。ＳＰＣ－Ａ１和Ｈ１２９９以及Ｈ３５８細(xì)胞，收集細(xì)胞抽提蛋白并定量，凝膠電泳，利用ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ檢測(cè)了邋ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在人支氣管上腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。逡逑

ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白表達(dá)量略高于ＨＢＥ細(xì)胞中的表達(dá)量。逡逑２．３．２邋Ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)逡逑利用免疫組化檢測(cè)了邋１５例肺腺癌組織臨床樣品，，結(jié)果如圖２－２所示，ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白逡逑在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)（棕色顯色），且主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。逡逑：Ａ邋／邋Ｂ邋＾逡逑Ｉ＾Ｉ逡逑圖２－２邋ｃｏｐｉｎｅ－３蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｏｐｉｎｅ－３邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑Ａ：邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋（ｌ0ｘ）；邋Ｂ：邋ｌｕｎｇ邋ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋（４０ｘ）逡逑２．３．３肺腺癌細(xì)胞胞漿與胞核蛋白的分離逡逑為驗(yàn)證細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒對(duì)細(xì)胞兩種組份的分離效果。首先利用逡逑肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。逡逑收集肺腺癌Ｈ１２９９和Ａ５４９細(xì)胞沉淀各２（ＨｉＬ，按２．２．８中方法對(duì)兩種細(xì)胞的胞漿胞逡逑核蛋白進(jìn)行抽提分離。如圖２－３所示，加入抽提試劑Ｂ前，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；加入抽提試逡逑劑Ｂ后，在低n蟯稈固跫孿赴て屏眩雋糲孿赴�。辶x希保峰義

本文編號(hào)：2592106