【摘要】：血管在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著十分重要的作用,腫瘤細胞通過血管獲得營養(yǎng),同時血管也為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供通道。如果缺乏毛細血管,腫瘤的直徑將被限制在1~2mm左右,從而容易發(fā)生壞死或凋亡。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),又稱血管通透因子,是最重要的血管生長刺激因子,它高度特異地與血管內(nèi)皮細胞的受體結(jié)合,直接參與腫瘤血管的生成,從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。迄今為止,VEGF家族陸續(xù)有7個成員被發(fā)現(xiàn),即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長因子(PIGF)。其中,VEGF-A在血管生成中發(fā)揮最重要的功能,因此通常簡稱為VEGF。VEGF的表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,因此通過轉(zhuǎn)錄因子對VEGF的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控是最主要的途徑。VEGF啟動子上包含很多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,比如SP1、HIF-1、Stat3和AP1等,這些轉(zhuǎn)錄因子不僅可直接結(jié)合在VEGF的啟動子上促進VEGF的轉(zhuǎn)錄,還可通過與生長因子、癌基因和抑癌基因的相互作用發(fā)揮調(diào)控VEGF的功能。除了目前已經(jīng)報道的轉(zhuǎn)錄因子外,新的調(diào)控VEGF表達的轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)以及調(diào)控機制值得我們進行深入的研究。為了進一步獲得新的可以調(diào)控VEGF表達的轉(zhuǎn)錄因子,我們將VEGF啟動子上-2304 bp到+73 bp長度的片段克隆到熒光素酶表達載體,利用熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬砗Y選可以調(diào)控VEGF表達的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明,在乳腺癌細胞ZR75-1內(nèi),通過對轉(zhuǎn)錄因子文庫中的704個轉(zhuǎn)錄因子進行篩選,我們得到未曾報道的可以調(diào)控VEGF表達的轉(zhuǎn)錄因子GATA1和DEK,它們可以升高VEGF啟動子報告基因的活性。因此,我們對GATA1和DEK在乳腺癌中調(diào)控VEGF表達的功能和機制進行了深入的研究。在乳腺癌細胞中,我們利用熒光素酶報告基因?qū)嶒�、熒光實時定量RT-PCR實驗和ELISA實驗得出,GATA1可以升高VEGF啟動子熒光素酶報告基因的活性,上調(diào)VEGF mRNA和蛋白的表達水平,而敲低GATA1可以抑制VEGF啟動子熒光素酶報告基因的活性,下調(diào)VEGF mRNA和蛋白的表達水平。在生物學(xué)功能方面,我們用細胞增殖實驗、劃痕實驗和成管實驗發(fā)現(xiàn),高表達GATA1的乳腺癌細胞上調(diào)VEGF蛋白的分泌,進而促進血管內(nèi)皮細胞HUVEC的增殖和遷移,在體外增強HUVEC細胞的成管能力,同時在雞胚絨毛尿囊膜實驗中,也可以促進新生血管的形成。相應(yīng)的,在敲低GATA1的乳腺癌細胞中會得到相反的結(jié)果。在GATA1調(diào)控VEGF表達的分子機制方面,染色質(zhì)免疫共沉淀實驗和EMSA實驗表明,GATA1結(jié)合在VEGF啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點的GATC序列處,而不是位于上游的GATA序列,并且可以募集組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SET7、RNA PolII和TFIIB到gatc序列處。set7可使h3k4發(fā)生單甲基化,通常激活基因的轉(zhuǎn)錄,我們的實驗結(jié)果也證實,set7可與gata1協(xié)同促進vegf的轉(zhuǎn)錄。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),gata1、set7、rnapolii和tfiib存在生理狀態(tài)下的相互作用,它們可能形成一個轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物來調(diào)控vegf的轉(zhuǎn)錄。進一步的研究發(fā)現(xiàn),gata1調(diào)控vegf的表達以及vegf介導(dǎo)的huvec細胞的增殖、遷移和血管形成都是通過set7來發(fā)揮作用。乳腺癌細胞的體外細胞增殖實驗和體內(nèi)裸鼠成瘤實驗表明,gata1也是通過set7來調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的生長和血管生成。對乳腺癌臨床標(biāo)本的分析表明,gata1和set7在乳腺癌中都是高表達的,均與vegf的表達和血管數(shù)量呈正相關(guān)。而且,通過對無病生存期(dfs)和總生存期(os)的分析,提示我們gata1和set7可能是乳腺癌的獨立預(yù)后指標(biāo),說明gata1和set7在乳腺癌中的顯著意義,為乳腺癌的治療提供新的思路和策略。另一方面,我們利用熒光素酶報告基因?qū)嶒�、熒光實時定量rt-pcr實驗和elisa實驗發(fā)現(xiàn),dek可以升高vegf啟動子報告基因的活性,上調(diào)vegfmrna和蛋白的表達水平,而敲低dek可以抑制vegf啟動子報告基因的活性,下調(diào)vegfmrna和蛋白的表達水平。在生物學(xué)功能方面,高表達dek的乳腺癌細胞上調(diào)vegf蛋白的分泌,進而可以促進血管內(nèi)皮細胞huvec的增殖和遷移,在體外增強huvec細胞的成管能力,在雞胚絨毛尿囊膜實驗中也可以促進新生血管的形成。相應(yīng)的,在敲低dek的乳腺癌細胞中會得到相反的結(jié)果。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),缺氧誘導(dǎo)因子hif-1α(hypoxia-induciblefactor-1α)與dek相互作用。由于hif-1α在調(diào)控vegf中起著十分關(guān)鍵的作用,我們研究了hif-1α在dek調(diào)控vegf表達的過程中是否發(fā)揮功能。因此,我們將hif-1α敲低后進行了熒光素酶報告基因?qū)嶒�、熒光實時定量rt-pcr實驗和elisa實驗,結(jié)果表明,dek調(diào)控vegf的表達部分依賴于hif-1α。我們進一步對dek調(diào)控vegf表達的分子機制進行了研究,染色質(zhì)免疫共沉淀的實驗結(jié)果說明,dek直接結(jié)合在vegf啟動子的dre序列處,同時通過與hif-1α相互作用間接地募集在hre序列處,而組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300在dre和hre處都有募集,并且dek可以影響hif-1α和p300在vegf啟動子上的募集能力。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),dek、hif-1α和p300存在生理狀態(tài)下的相互作用,它們形成一個復(fù)合物來調(diào)控vegf的轉(zhuǎn)錄。利用乳腺癌細胞mda-mb-231進行的裸鼠成瘤實驗表明,dek是以依賴和不依賴hif-1α兩種途徑來調(diào)控腫瘤的生長和血管形成。在臨床意義上,對乳腺癌臨床標(biāo)本的分析顯示,dek與vegf的表達和血管數(shù)量呈正相關(guān)。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)新的可以調(diào)控vegf表達的轉(zhuǎn)錄因子gata1和dek,分別通過與SET7相互作用和部分依賴HIF-1α的調(diào)節(jié)機制來調(diào)控VEGF的表達和VEGF介導(dǎo)的HUVEC細胞的增殖、遷移和成管,以及調(diào)控乳腺癌細胞的生長和腫瘤血管生成,在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
【圖文】：

調(diào)控VEGF表達的轉(zhuǎn)錄因子的篩選在ZR75-1細胞中轉(zhuǎn)染VEGF-Luc和空載體或轉(zhuǎn)錄因子，24h后收取細胞進

圖 1.1.1 敲低 GATA1 抑制 VEGF 啟動子的活性在 ZR75-1 細胞、MCF-7 細胞和 MDA-MB-231 細胞中分別轉(zhuǎn)染 VEGF-Luc和兩條 GATA1 shRNA 或 control shRNA，48h 后收取細胞進行熒光素酶報告基因活性檢測實驗。Western blot 雜交實驗檢測 GATA1 的表達情況。圖示數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實驗的平均值，與對照組相比，，*p < 0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R73-3

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本文編號：2585770