【摘要】：第一部分微泡在CML進展中作用的生物信息學研究及實驗驗證目的：微泡(MV)由母體細胞胞膜脫落,是一種新型的細胞間信息交流載體,含有母體細胞豐富的特征性內(nèi)容物,同時能夠?qū)?nèi)容物傳遞至靶細胞全面改造受者細胞的生物學行為；我們前期的研究發(fā)現(xiàn)K562-MV中包含癌性酪氨酸激酶BCR-ABL1 mRNA以及大量癌性miRNA分子,能夠通過傳遞BCR-ABL1及miRNA分子惡性轉(zhuǎn)化正常造血細胞成瘤,與CML進展機制極為契合。本項目擬在前期研究的基礎上,進一步明確K562-MV誘導正常造血細胞癌變的分子機制所在。方法：體外培養(yǎng)K562細胞,采用梯度離心法收集并鑒定MV,同時進行體外成瘤誘導實驗；選取受轉(zhuǎn)化不同時間點的受者細胞(0、7、14、21天),以及K562-MV,提取其RNA,進行表達譜及miRNA測序工作。測序結(jié)果采用生物信息學分析,獲取誘導過程中具有顯著性差異的基因及miRNA,根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子譜及miRNA的靶點預測情況,構(gòu)建誘導轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的前反饋環(huán)(FFL)。對于篩選出的miR-146b,采用熒光素酶實驗熒光猝滅證明其靶基因為NUMB蛋白,轉(zhuǎn)染miR-146b至K562-MV及K562細胞中,人為提升／降低MV中特定miR-146b的水平,觀察對誘導轉(zhuǎn)化過程的影響。在此基礎上,2%瓊脂糖電泳檢測不同時間點靶細胞中DNA斷裂情況；實時定量PCR和western blot檢測誘導過程中不同時間點細胞內(nèi)NUMB、MSI2、AICDA等分子的表達水平；ROS試劑盒檢測誘導過程中不同時問點靶細胞內(nèi)ROS水平的改變；同時,采用慢病毒體系轉(zhuǎn)染NUMB蛋白至骨髓單個核細胞中,觀察K562-MV對這部分轉(zhuǎn)染NUMB的細胞的誘導效率如何,同時瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA雙鏈斷裂情況。最后,收集臨床CML患者標本,實時定量PCR檢測其外周血MV中的miR-146b水平,并比較不同組間的差異。結(jié)果：通過精密質(zhì)控,我們所留取的五個樣本(K562-MV、d0、d7、d14、d21樣本)RNA質(zhì)量合格,成功的進行了表達譜測序及miRNA測序工作,并獲取測序數(shù)據(jù)。我們分析了測序數(shù)據(jù)中在各個時間點具有顯著性差異的基因及miRNA,根據(jù)功能將其歸類,篩選出可能影響惡性轉(zhuǎn)化過程的候選基因及miRNA分子；同時根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子表達水平的波動,構(gòu)建了多個以基因-轉(zhuǎn)錄因子-miRNA分子構(gòu)成的前反饋環(huán),從基因和miRNA的功能角度出發(fā),探討前反饋環(huán)在惡性轉(zhuǎn)化中的可能的作用及機制。最終結(jié)果提示miR-146b是惡性轉(zhuǎn)化過程中波動最大的miRNA分子,通過生物信息學預測,其可能結(jié)合NUMB mRNA調(diào)控其表達,而后者是影響CML疾病進展的重要分子,NUMB-STAT-miR-146b這一前反饋環(huán)可能是惡性轉(zhuǎn)化的重要分子機制。根據(jù)生物信息學預測結(jié)果,我們通過轉(zhuǎn)染的方式上調(diào)以及下調(diào)MV中miR-146b的水平,再以這部分MV誘導正常細胞,結(jié)果提示上調(diào)MV中的miR-146b后能夠顯著加速惡性轉(zhuǎn)化進程：下調(diào)miR-146b則無明顯影響。其機制是上調(diào)MV中的miR-146b后,受者細胞中的NUMB蛋白水平較前進一步下降,后者通過促進AICDA蛋白水平以及細胞內(nèi)ROS水平,誘發(fā)細胞出現(xiàn)雙鏈DNA斷裂等基因組不穩(wěn)定性成瘤。采用慢病毒轉(zhuǎn)染NUMB至受者細胞中,人為提高其NUMB蛋白水平,再以普通K562-MV進行誘導,結(jié)果提示轉(zhuǎn)化效率較前明顯下降,雙鏈DNA等基因組不穩(wěn)定性同樣下降�；颊邩吮痉矫�,我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性期患者外周血MV中的miR-146b水平顯著低于急變期患者外周血MV中的水平。結(jié)論：我們在這部分研究中基于前期的測序結(jié)果,利用表達和調(diào)控網(wǎng)絡分析,探索了K562-MV轉(zhuǎn)化正常細胞為白血病樣細胞這一體外誘導模型可能的轉(zhuǎn)化機制；結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCR-ABL1下游調(diào)控因子miR-146b通過靶向作用于NUMB這一CML疾病進展的關(guān)鍵蛋白,以及幾個影響基因組不穩(wěn)定和細胞增殖的重要基因促進轉(zhuǎn)化。我們的工作對探索CML轉(zhuǎn)化和供者細胞白血病意義重大,并為研究正常細胞向腫瘤樣細胞轉(zhuǎn)化提供了一個優(yōu)秀模型。第二部分BCR-ABL1陽性微泡惡性轉(zhuǎn)化正常造血細胞目的：CML是一種具有特征性的BCR-ABL1融合基因表達的骨髓增殖性腫瘤。目前TKI治療CML已經(jīng)成為經(jīng)典的疾病治療模式,患者長期無病生存率達90%以上。長期緩解患者能否安全的停用TKI類藥物是最為引人關(guān)注的問題。但目前仍缺乏確切的證據(jù)指向哪一部分患者能夠在停藥后保持穩(wěn)定的緩解狀態(tài),同時缺乏必要的動物模型及優(yōu)秀的監(jiān)測指標來指導停藥工作。本部分擬從殘留的白血病干細胞檢測出發(fā),分析其MV在停藥研究中的監(jiān)測作用及可能的生物學意義。方法：本研究納入的停藥病例來自武漢協(xié)和醫(yī)院門診及同濟醫(yī)院門診,患者遵循自主知情同意原則參加本觀察。我們首先回顧了2000年1月至2014年12月間1057名門診確診的慢性期、加速期及急變期CML患者,共22名慢性期及加速期患者在監(jiān)測過程中停藥�；仡櫺苑治龌颊咄Ｋ幒髲桶l(fā)的時間和疾病特征,比較停藥后持續(xù)緩解組與復發(fā)組之間的特征差異；患者在停藥前行骨髓細胞學穿刺,獲取骨髓標本,停藥后每月抽取外周血,實時定量PCR方法檢測外周血細胞中及MV中BCR-ABL1 mRNA拷貝數(shù)改變。骨髓標本通過流式細胞儀檢測慢性髓系白血病干細胞的數(shù)目和比例,同時檢測骨髓中髓源抑制細胞的亞群和數(shù)目；比較停藥后持續(xù)緩解組與復發(fā)組之間干細胞及髓源抑制性細胞的差異。將這部分骨髓尾靜脈注入經(jīng)亞致死量照射的NOD-SCID小鼠體內(nèi),定期稱取小鼠體重,觀察小鼠活動狀態(tài),于實驗的第2周開始尾靜脈采血,實時定量PCR檢測人源性BCR-ABL1 mRNA水平；實驗的第35天至第60天,處死小鼠,獲取肝臟、脾臟、骨髓等組織,實時定量PCR檢測上述組織中的BCR-ABL1水平,同時通過人源性抗CD45及抗CD38抗體進行免疫組化,觀察上述組織中是否存在人源性細胞。體外以培養(yǎng)基及無MV的上清做對照,觀察K562-MV對髓源抑制細胞的擴增作用。結(jié)果：我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn),10/22名患者在觀察期內(nèi)復發(fā),分別于停藥的1-14個月之間發(fā)生,其中早期復發(fā)(5個月之內(nèi))為6例。6例重新口服TKI并迅速獲得分子學反應,4例患者拒絕繼續(xù)服藥,但仍未喪失主要分子學緩解,目前仍持續(xù)監(jiān)測中。根據(jù)觀察期內(nèi)是否復發(fā),我們將22名患者分為2部分進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),停藥后復發(fā)及TFR患者在TKI持續(xù)時間(70.5±7.7m vs.76.7±6.3m, P=0.54)。達到MMR時間(10.3±1.6 vs.7.5±1.4,P=0.21)以及年齡(29.2±4.3 vs.36.4±6.2,P=0.34)等方面均沒有顯著性差異。骨髓流式細胞學檢測發(fā)現(xiàn)：22例中有20例患者骨髓中能檢測到CD34+CD38-CD26+細胞即慢性髓系白血病干細胞。然而在停藥后緩解組和復發(fā)組患者之間,CD34+CD38-CD26+細胞數(shù)缺乏顯著性差異(0.27%±0.07 vs 0.24%±0.07,P0.05)。將這部分骨髓植入小鼠體內(nèi)后,44例小鼠中有9例出現(xiàn)明顯的倦怠、豎毛、活動減少和體重下降,在9例注射患者骨髓單個核細胞的小鼠中有6例出現(xiàn)脾大(圖4C),符合慢性粒細胞白血病的疾病特征。通過人的抗CD45和抗CD38的免疫組化鑒定,在小鼠的骨髓、肝脾腎中存在一種表達人源性CD45、CD38的類白血病細胞的惡性細胞。在停藥后分子學復發(fā)組的7例患者骨髓,有5例使小鼠出現(xiàn)了白血病(No.3,4,11,12,17導致7只小鼠成瘤)癥狀；而在TFR組,只有2例患者的骨髓使小鼠出現(xiàn)了白血病癥狀,提示小鼠模型能夠部分預測患者停藥后是否復發(fā)。此外,我們發(fā)現(xiàn)患者骨髓中CD14+HLA-DRLow、CD14+HLA-DRLow/-、CD14+HLA-DR-、 CD11b+CD3/14/16/19/20/56-、CD33+HLA-DR-CD14/56-等五群MDSC組分在停藥后復發(fā)組均明顯升高(P0.05),而K562-MV能夠顯著擴增MDSC。監(jiān)測方面,我們發(fā)現(xiàn)與細胞中一致,MV中的BCR-ABL1 mRNA水平隨患者的治療反應不同而改變。我們將完全分子學緩解的患者分為2組,服用TK1組和接受異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)組。有趣的是,在allo-HSCT組MV內(nèi)的P210水平明顯低于接受TKI組(2.10±0.24 vs 0.72±0.15,P0.05)。在22例停用TKI病人中,后期復發(fā)患者的MV內(nèi)BCR-ABL1拷貝數(shù)明顯較TFR組高。結(jié)論：本部分研究首次報道中國CML患者停藥數(shù)據(jù),同時我們探索了CML-LSC與停藥后復發(fā)之間的關(guān)系。病人停藥后是否復發(fā)取決于LSC功能而不是數(shù)目,尤其是分泌MV以及通過MV擴增MDSC的相關(guān)能力。小鼠異種移植模型結(jié)果與停藥后患者復發(fā)結(jié)果部分重疊,為研究LSC作用和預測復發(fā)提供了一個新穎、實用的選擇。MV檢測可能增加LSC檢測的敏感性,為TKI停藥患者制定合適的分子學檢測方案提供重要提示。
【圖文】：

圖１．五個測序樣本中所有基因、ｍｉＲＮＡ表達差異及各樣本間重疊情況

ＴuQ（３、Ｗｎｔ、和ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ通路有等量的上調(diào)、下調(diào)基因。逡逑根據(jù)轉(zhuǎn)化過程中各階段表達變化將ＤＥＧｓ和ＯＥＭｓ分成８組：ＤＤＤ、ＤＤＵ、ＤＵＤ、逡逑ＤＵＵ、ＵＤＤ、ＵＤＵ、ＵＵＤ和ＵＵＵ（Ｄ：下調(diào)，Ｕ：上調(diào)）（圖２）。在轉(zhuǎn)化過程中有７０２逡逑個基因持續(xù)表達增加（ＵＵＵ組），主要在＂翻譯起始＂和》細胞周期過程＂富集（補充表逡逑Ｓ５）。４０６個持續(xù)下調(diào)的基因（ＤＤＤ）主要富集于Ｕ免疫應答，對刺激應答＂和＂產(chǎn)生細逡逑胞因子＂通路。根據(jù)轉(zhuǎn)化過程第３期表達變化（上調(diào)或下調(diào)），將該８組ｍｉＲＮＡ分成逡逑２組（圖２Ａ和Ｂ）。第３期中許多上調(diào)的ｍｉＲＮＡｓ均被報道為痛性ｍｉＲＮＡｓ如逡逑ｍｉ民－１７／１８ａ／２０ａ／９２ａ／３７８ａ／１３０ｂ，它們可能促進細胞增殖和遷移。相反，，轉(zhuǎn)化過程中許逡逑多抑癌邋ｍｉ民ＮＡｓ邋或調(diào)亡相關(guān)邋ｍｉＲＮＡｓ，如邋ｍｎｉ－１５／１６＾８１ａ／３０ｄ／３０ｅ／％ａ／１４２－３ｐ邋（ＵＤＤ邋組）逡逑均下調(diào)。ＤＤＤ組幾乎全部ｍｉＲＮＡｓ，包括ｍｉＲ－１４８ａ／ｌｅｔ－７／１９９ａｂ／３０ｅ被報道有抑制腫瘤逡逑或促調(diào)亡的功能，這與轉(zhuǎn)化過程中的發(fā)現(xiàn)一致。逡逑３５逡逑
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：2585820