【摘要】：目的:利用家蠅幼蟲抗菌肽針對急性淋巴細胞瘤sup-b15進行干預實驗,并通過實驗證明家蠅幼蟲抗菌肽對腫瘤細胞sup-b15有抑制作用。研究內(nèi)容由三部分組成:1.對比研究家蠅幼蟲抗菌肽的分離純化物與粗提物對sup-b15的抑制效能;2.驗證家蠅幼蟲抗菌肽聯(lián)合伊馬替尼對腫瘤細胞sup-b15是否具有增強抑制的作用;3.建立急淋白血病C57BL/6小鼠模型并探究家蠅幼蟲抗菌肽對其是否具有延長生存期的作用。方法:通過針刺誘導、研磨、離心、C18柱固相萃取等方法制備家蠅三齡幼蟲抗菌肽粗提物,利用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進行分離純化,應用CCK-8試劑盒檢測細胞抑制率,采用流式細胞儀檢測其誘導凋亡的效果。采用臺盼蘭拒染法,血球計數(shù)板計數(shù)并計算細胞存活率,利用倒置光學顯微鏡觀察細胞并拍照。選取健康的C57BL/6小鼠,經(jīng)環(huán)磷酰胺免疫抑制后,通過尾靜脈接種腫瘤細胞sup-b15,以此建立急淋白血病小鼠模型。對其實施家蠅幼蟲抗菌肽干預后,觀察小鼠生存時間并繪制生長曲線,計算生命延長率。利用全自動血液檢測儀對小鼠外周血細胞記數(shù),并對結果進行統(tǒng)計學分析,然后進行骨髓推片檢測并計算造模成功率。結果:實驗一:利用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)分離純化得到8種純化物,按照蛋白含量增加(Increased)和新生成(Generate)分別標記為I1、I2、I3、I4組和G1,G2、G3、G4組。家蠅幼蟲抗菌肽粗提物(Extracts)標記為E0組。通過CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn),8種純化物中有4種蛋白及粗提物(E0組)對sup-b15細胞有增殖抑制作用,細胞生存率均值分別為I1:71.4%、I2:78.5%、I4:64.1%、G2:68.6%、E0:56.1%。采用流式細胞儀檢測其誘導細胞凋亡的效果,其凋亡率均值分別為I1:16.73%、I2:9.79%、I4:18.60%、G2:11.85%、E0:35.94%。實驗二:光學顯微鏡下分別觀察實驗組與對照組的細胞生長狀況,結果為:低倍鏡與高倍鏡下對照組的細胞增長旺盛,細胞密度大,細胞結構完整;實驗組觀察到的結果相對于對照組而言細胞出現(xiàn)不同程度的增殖緩慢,密度減小,形態(tài)相對不完整。其中聯(lián)合用藥組抑制效果最為明顯,伊馬替尼組的抑制效果較抗菌肽組明顯。臺盼蘭染色后鏡下血球計數(shù)板計數(shù),細胞存活率分別為:對照組:(91.37±1.68)%;單一抗菌肽用藥組:(54.71±2.76)%;單一伊馬替尼用藥組:(38.04±1.55)%;伊馬替尼抗菌肽聯(lián)合用藥組:(21.19±1.27)%。實驗三:實驗初期(前4天)各組C57BL/6小鼠未出現(xiàn)明顯異常反應。接種第5天后實驗組小鼠生存質(zhì)量較對照組小鼠出現(xiàn)不同程度的下降,第8天開始實驗小鼠出現(xiàn)死亡。各實驗組中造模成功的C57BL/6小鼠生存時間分別為:實抗組12.52±1.39天;實對組10.9±1.59天;實P組10.8±1.97天。計算得知實抗組生命延長率為13.15%。各實驗組中造模成功的及對照組所有的C57BL/6小鼠外周血進行細胞檢測,結果顯示各實驗組小鼠白細胞數(shù)量明顯增高,紅細胞及血小板數(shù)量明顯減少,對照組小鼠各血細胞數(shù)量正常。骨髓推片鏡下觀察到小鼠的有核細胞增生異�；钴S,原始淋巴細胞及幼稚淋巴細胞明顯增多,占有核細胞的比例大幅度上升,成熟的淋巴細胞相對較少,其余各系統(tǒng)細胞較正常情況明顯減少。實驗組共有45只C57BL/6小鼠,其中造模成功的有13只,計算可得小鼠造模成功率為28.89%。結論:1.家蠅幼蟲抗菌肽對腫瘤細胞sup-b15具有增殖抑制及誘導凋亡的作用,且家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對腫瘤細胞的抑制效果較純化蛋白明顯。2.家蠅幼蟲抗菌肽可聯(lián)合伊馬替尼一同對腫瘤細胞sup-b15發(fā)揮抗癌作用,較單獨用藥時的抑制作用更強。而單一應用家蠅幼蟲抗菌肽對腫瘤細胞sup-b15的抑制效果不及伊馬替尼。3.家蠅幼蟲抗菌肽在急性淋巴白血病的C57BL/6模型小鼠體內(nèi)存在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文.2 CCK-8 試劑盒檢測家蠅幼蟲抗菌肽對 sup-b15 細胞生長抑制的結果CCK-8 結果顯示，，與對照組相比，I1、I2、I4、G2、E0 組細胞生長得到明顯，五組細胞的生存率（圖 1-2）分別為（71.4±3.2）%、（78.5±2.3）%、（646.5）%、（68.6±3.4）%、（56.1±2.5）%,差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其與對照組相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

6圖 1-3 各組抗菌肽對 sup-b15 細胞的凋亡作用注：其中圖 ABCDEF 分別代表對照組、I1、I2、I4、G2、E0 組表 1-1 各組抗菌肽作用 sup-b15 細胞凋亡結果組別 早期凋亡（%） 晚期凋亡與壞死（%）對照組 2.27±0.28 2.67±0.42I1 9.37±1.44 7.36±1.56I2 6.67±1.69 3.12±1.17I4 11.16±1.75 7.44±1.21G2 6.52±1.36 5.33±1.83E0 23.22±2.11 12.72±1.97
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36

【參考文獻】

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本文編號：2583504