【摘要】：目的:利用家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽針對(duì)急性淋巴細(xì)胞瘤sup-b15進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15有抑制作用。研究?jī)?nèi)容由三部分組成:1.對(duì)比研究家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽的分離純化物與粗提物對(duì)sup-b15的抑制效能;2.驗(yàn)證家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽聯(lián)合伊馬替尼對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15是否具有增強(qiáng)抑制的作用;3.建立急淋白血病C57BL/6小鼠模型并探究家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)其是否具有延長(zhǎng)生存期的作用。方法:通過(guò)針刺誘導(dǎo)、研磨、離心、C18柱固相萃取等方法制備家蠅三齡幼蟲(chóng)抗菌肽粗提物,利用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)進(jìn)行分離純化,應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞抑制率,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)凋亡的效果。采用臺(tái)盼蘭拒染法,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率,利用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。選取健康的C57BL/6小鼠,經(jīng)環(huán)磷酰胺免疫抑制后,通過(guò)尾靜脈接種腫瘤細(xì)胞sup-b15,以此建立急淋白血病小鼠模型。對(duì)其實(shí)施家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽干預(yù)后,觀察小鼠生存時(shí)間并繪制生長(zhǎng)曲線,計(jì)算生命延長(zhǎng)率。利用全自動(dòng)血液檢測(cè)儀對(duì)小鼠外周血細(xì)胞記數(shù),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,然后進(jìn)行骨髓推片檢測(cè)并計(jì)算造模成功率。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:利用反相高效液相色譜儀(RP-HPLC)分離純化得到8種純化物,按照蛋白含量增加(Increased)和新生成(Generate)分別標(biāo)記為I1、I2、I3、I4組和G1,G2、G3、G4組。家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽粗提物(Extracts)標(biāo)記為E0組。通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn),8種純化物中有4種蛋白及粗提物(E0組)對(duì)sup-b15細(xì)胞有增殖抑制作用,細(xì)胞生存率均值分別為I1:71.4%、I2:78.5%、I4:64.1%、G2:68.6%、E0:56.1%。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果,其凋亡率均值分別為I1:16.73%、I2:9.79%、I4:18.60%、G2:11.85%、E0:35.94%。實(shí)驗(yàn)二:光學(xué)顯微鏡下分別觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,結(jié)果為:低倍鏡與高倍鏡下對(duì)照組的細(xì)胞增長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞密度大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整;實(shí)驗(yàn)組觀察到的結(jié)果相對(duì)于對(duì)照組而言細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增殖緩慢,密度減小,形態(tài)相對(duì)不完整。其中聯(lián)合用藥組抑制效果最為明顯,伊馬替尼組的抑制效果較抗菌肽組明顯。臺(tái)盼蘭染色后鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),細(xì)胞存活率分別為:對(duì)照組:(91.37±1.68)%;單一抗菌肽用藥組:(54.71±2.76)%;單一伊馬替尼用藥組:(38.04±1.55)%;伊馬替尼抗菌肽聯(lián)合用藥組:(21.19±1.27)%。實(shí)驗(yàn)三:實(shí)驗(yàn)初期(前4天)各組C57BL/6小鼠未出現(xiàn)明顯異常反應(yīng)。接種第5天后實(shí)驗(yàn)組小鼠生存質(zhì)量較對(duì)照組小鼠出現(xiàn)不同程度的下降,第8天開(kāi)始實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)死亡。各實(shí)驗(yàn)組中造模成功的C57BL/6小鼠生存時(shí)間分別為:實(shí)抗組12.52±1.39天;實(shí)對(duì)組10.9±1.59天;實(shí)P組10.8±1.97天。計(jì)算得知實(shí)抗組生命延長(zhǎng)率為13.15%。各實(shí)驗(yàn)組中造模成功的及對(duì)照組所有的C57BL/6小鼠外周血進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè),結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組小鼠白細(xì)胞數(shù)量明顯增高,紅細(xì)胞及血小板數(shù)量明顯減少,對(duì)照組小鼠各血細(xì)胞數(shù)量正常。骨髓推片鏡下觀察到小鼠的有核細(xì)胞增生異�；钴S,原始淋巴細(xì)胞及幼稚淋巴細(xì)胞明顯增多,占有核細(xì)胞的比例大幅度上升,成熟的淋巴細(xì)胞相對(duì)較少,其余各系統(tǒng)細(xì)胞較正常情況明顯減少。實(shí)驗(yàn)組共有45只C57BL/6小鼠,其中造模成功的有13只,計(jì)算可得小鼠造模成功率為28.89%。結(jié)論:1.家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15具有增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用,且家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果較純化蛋白明顯。2.家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽可聯(lián)合伊馬替尼一同對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15發(fā)揮抗癌作用,較單獨(dú)用藥時(shí)的抑制作用更強(qiáng)。而單一應(yīng)用家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞sup-b15的抑制效果不及伊馬替尼。3.家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽在急性淋巴白血病的C57BL/6模型小鼠體內(nèi)存在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文.2 CCK-8 試劑盒檢測(cè)家蠅幼蟲(chóng)抗菌肽對(duì) sup-b15 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的結(jié)果CCK-8 結(jié)果顯示，，與對(duì)照組相比，I1、I2、I4、G2、E0 組細(xì)胞生長(zhǎng)得到明顯，五組細(xì)胞的生存率（圖 1-2）分別為（71.4±3.2）%、（78.5±2.3）%、（646.5）%、（68.6±3.4）%、（56.1±2.5）%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其與對(duì)照組相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

6圖 1-3 各組抗菌肽對(duì) sup-b15 細(xì)胞的凋亡作用注：其中圖 ABCDEF 分別代表對(duì)照組、I1、I2、I4、G2、E0 組表 1-1 各組抗菌肽作用 sup-b15 細(xì)胞凋亡結(jié)果組別 早期凋亡（%） 晚期凋亡與壞死（%）對(duì)照組 2.27±0.28 2.67±0.42I1 9.37±1.44 7.36±1.56I2 6.67±1.69 3.12±1.17I4 11.16±1.75 7.44±1.21G2 6.52±1.36 5.33±1.83E0 23.22±2.11 12.72±1.97
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-36

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2583504