【摘要】：胰腺癌是惡性程度最高的消化道腫瘤之一。盡管胰腺癌的診斷和治療技術不斷提高,但是病人的生存狀況并沒有明顯的改善,這與胰腺癌發(fā)病隱匿,惡性程度高,發(fā)病時多伴有轉移,發(fā)病機制復雜。而根本上,胰腺癌的發(fā)病機制是由于多個基因失調控而成。溴樣結構域蛋白4(BRD4)是BET蛋白超家族的一員,其功能涉及基因組復制,轉錄,細胞周期的調控,以及促進腫瘤的進展等過程。已有的研究證實,BRD4參與了可以在腦膠質瘤、白血病、肝癌,淋巴瘤、惡性黑色素瘤,肝癌等惡性腫瘤的進展中起到重要的作用,抑制BRD4可以有效的降低某些癌基因的表達,但是其在胰腺癌中的作用還有待于進一步的闡述。在本研究中,為了闡述BRD4基因在胰腺癌中的功能,進行了以下五個部分的工作：比較胰腺癌細胞株和正常的胰腺導管上皮細胞之間BRD4的表達差異；構建BRD4基因干擾載體,并轉染入胰腺癌細胞株PANC-1中MIAPaCa-2中,證實在細胞株中BRD4穩(wěn)定沉默；研究BRD4沉默后對胰腺癌細胞系生長、增殖、侵襲、遷移等生物學特性的影響；探討胰腺癌細胞BRD4沉默以后對吉西他濱化療敏感性的影響；研究BRD4在胰腺癌中調控SHH信號通路。第一部分正常的胰腺導管上皮細胞與胰腺癌細胞株中BRD4的表達的差異目的：為了檢測正常的胰腺導管上皮細胞與胰腺癌細胞株中BRD4的表達的差異方法：通過westernblot和實時定量PCR的方法檢測胰腺癌細胞株COLO357, L3.6PL, SW1990, PANC-1, Capan-2和MIAPaCa-2和正常的胰腺導管上皮細胞株HPDE之間的BRD4表達差異。結果：通過westernblot實驗證實在胰腺癌細胞株中BRD4蛋白的表達明顯高于正常的胰腺導管上皮細胞株,同樣,通過實時定量PCR的方法證實在胰腺癌中BRD4的mRNA的表達明顯高于正常的胰腺導管上皮細胞株。在胰腺癌細胞株中BRD4表達最高的是PANC-1和MIAPaCa-2。結論：在胰腺癌中高表達的BRD4可能促進胰腺癌的進展。第二部分：建立穩(wěn)定轉染shBRD4的細胞系目的：構建BRD4基因的shRNA載體,轉染細胞,并檢測其效果。方法：首先設計針對BRD4不同位點特異性siRNA序列,合成寡核苷酸,然后將其連接到慢病毒Phblv-u6-puro載體上,瓊脂糖電泳及測序鑒定。進行大腸桿菌轉化,質粒大量抽提。獲得的質粒,轉染293T細胞進行病毒包裝。最后用Phblv-u6-puro shBRD4感染胰腺癌細胞PANC-1和MIAPaCa-2,應用westernblot檢測干擾效果。結果：本實驗成功構建鏈接BRD4特異性siRNA序列慢病毒Phblv-u6-puro載體；然后轉染Phblv-u6-puro shBRD4進入胰腺癌細胞系PANC-1和MIAPaCa-2,應用westernblot實驗檢測干擾效果,證明成功構建了穩(wěn)定沉默BRD4的胰腺癌細胞株PANC-1和MIAPaCa-2。結論：成功構建Phblv-u6-puro shBRD4載體,獲得穩(wěn)定沉默BRD4的胰腺癌細胞株PANC-1和MIAPaCa-2。第三部分BRD4沉默后對胰腺癌細胞株生物學行為的影響目的：研究BRD4沉默后對胰腺癌細胞株細胞活性、增殖、侵襲、遷移等生物學行為的影響。方法：胰腺癌細胞株穩(wěn)定沉默BRD4后,通過CCK8、平板克隆實驗、transwell小室侵襲和遷移實驗、劃痕實驗、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗等檢驗胰腺癌細胞系細胞活性、增殖、侵襲、遷移,體內(nèi)腫瘤生長等生物學行為的變化。結果：通過CCK8實驗證實,shBRD4PANC-1和shBRD4MIAPaCa-2的細胞活性較shcontrolPANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細胞活性明顯降低(P0.05)。通過平板克隆實驗證實,shBRD4PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的增殖能力較shcontrolPANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細胞增殖能力明顯降低(P0.05)。細胞劃痕實驗和transwell小室實驗結果顯示胰腺癌細胞株PANC-1、MIAPaCa-2在BRD4沉默后,胰腺癌細胞株shBRD4 PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的遷移能力明顯低于轉染了shcontrol PANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細胞株(P0.05)。通過鋪膠的transwell小室實驗,證實胰腺癌細胞株 shBRD4 PANC-1和shBRD4 MIAPaCa-2的侵襲能力明顯低于轉染了shcontrol PANC-1和shcontrol MIAPaCa-2的細胞株(P0.05)。裸鼠成瘤實驗檢測BRD4基因沉默后細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。將裸鼠隨機分成2組,分別皮下接種shBRD4PANC-1和shcontrol PANC-1胰腺癌細胞株后,每3天觀察腫瘤的大小,共觀察21天,結果發(fā)現(xiàn)shBRD4PANC-1組腫瘤的生長速度明顯低于shcontrol PANC-1 (P0.05)。21天后處死裸鼠,將腫瘤稱重,shBRD4PANC-1組腫瘤的重量明顯低于shcontrol PANC-1 (P0.05)。通過免疫組化檢查結果示shBRD4 PANC-1細胞系形成的腫瘤的Ki-67比shcontrol PANC-1細胞系形成的腫瘤的Ki-67值明顯下降(P0.05)。結論：BRD4沉默后對胰腺癌細胞株的生長、增殖、侵襲、遷移和裸鼠成瘤能力有著明顯的抑制作用。第四部分：BRD4沉默后胰腺癌對吉西他濱的敏感性的影響目的：探討B(tài)RD4沉默后胰腺癌細胞對吉西他濱化療敏感性的作用。方法：應用實時定量PCR檢測吉西他濱對胰腺癌細胞株BRD4的mRNA表達的影響。應用westernblot檢測吉西他濱對胰腺癌細胞株BRD4的蛋白表達的影響。應用流式細胞儀檢測BRD4沉默聯(lián)合吉西他濱可對胰腺癌細胞株凋亡率的影響。結果：將胰腺癌細胞PANC-1、MIAPaCa-2分別接受吉西他濱(2umol/L)干預,實時定量PCR檢測BRD4 mRNA表達水平,mRNA相對表達水平明顯升高(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。westernblot檢測BRD4蛋白表達水平,蛋白表達水平明顯升高(P0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。流式細胞術檢查結果顯示,在胰腺癌細胞中當BRD4沉默后相對于對照組,其細胞凋亡率明顯的增加,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。而當BRD4沉默后聯(lián)合吉西他濱治療時,相對于對照組和BRD4沉默組,細胞的凋亡率明顯的增加,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：BRD4沉默和吉西他濱具有協(xié)同治療胰腺癌的作用。第五部分：胰腺癌細胞中BRD4調控SHH信號通路目的：為了揭示在胰腺癌細胞系中BRD4和SHH信號通路之間的關系方法：當BRD4沉默后,用westernblot檢測SHH信號通路靶基因SHH, PTHC1,GLI1蛋白的表達,用實時定量PCR方法檢測SHH信號通路靶基因SHH,PTHC1,GLI1的mRNA表達。結果：首先通過westemblot實驗證實在PANC-1、MIAPaCa-2細胞株中BRD4沉默后,SHH信號通路的下游靶基因SHH, PTHC1, GLI1的蛋白表達明顯的降低。接著通過實時定量PCR證實在PANC-1、MIAPaCa-2細胞株中BRD4沉默后,SHH信號通路的下游靶基因SHH, PTHC1, GLI1的mRNA表達明顯的降低。為了進一步證實在胰腺癌中是可以經(jīng)過非配體依賴途徑調控SHH信號通路,我們將細胞株中加入hrSHH, westemblot實驗證實在PANC-1、MIAPaCa-2 BRD4沉默細胞株中,SHH信號通路的下游靶基因PTHC1, GLI1的蛋白表達仍然明顯的降低；實時定量PCR證實在PANC-1、MIAPaCa-2 BRD4沉默細胞株中,SHH信號通路的下游靶基因PTHC1, GLI1的mRNA表達仍然明顯的降低。結論：在胰腺癌中,BRD4可以通過配體依賴和非配體依賴途徑調控SHH信號通路。
【圖文】：

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本文編號：2582516