【摘要】：第一部分GRHL3和c-MYC在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義目的:研究食管鱗癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)患者鱗癌組織及癌旁組織中轉(zhuǎn)錄因子GRHL3(Grainyhead-like 3,GRHL3)和c-MYC的表達(dá)情況,并在基因水平和蛋白水平分析GRHL3和c-MYC表達(dá)水平之間的關(guān)系,分析GRHL3和c-MYC與ESCC患者臨床病理特征的關(guān)系。方法:1收集2015年6月至2016年9月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科行腫瘤切除并經(jīng)病理證實(shí)的64例ESCC患者的ESCC組織和癌旁組織,將每例標(biāo)本分為2份,按下述兩種方法處理:(1)置于液氮中,然后置于-80℃超低溫冰箱中貯存以備提取RNA;(2)以4%甲醛溶液固定以備制作組織蠟塊,用于免疫組化染色。2采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法檢測(cè)ESCC組織、癌旁組織中GRHL3和c-MYC m RNA的表達(dá)水平,在基因水平分析其相關(guān)性。3應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)ESCC組織、癌旁組織中GRHL3和c-MYC蛋白表達(dá)水平,并在蛋白水平分析其相關(guān)性。4分析ESCC組織內(nèi)GRHL3和c-MYC蛋白表達(dá)水平與患者臨床特征關(guān)系。結(jié)果:1 ESCC組織中GRHL3 m RNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織[(2.85±2.83)vs.(2.06±2.02),P0.01],ESCC組織中c-MYC m RNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(5.13±5.11 vs.2.03±2.00,P0.01)。GRHL3與c-MYC m RNA的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.001)。2與癌旁組織相比,ESCC組織中GRHL3蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(81.30%vs.25.00%,P0.001),ESCC組織中c-MYC蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平均顯著升高(42.20%vs.20.30%,P0.01)。ESCC組織中GRHL3蛋白表達(dá)和c-MYC蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P0.001)。該結(jié)果表明在ESCC患者GRHL3和c-MYC表達(dá)在基因水平和蛋白水平上是一致的。3 ESCC組織中GRHL3蛋白表達(dá)情況與腫瘤分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P0.001;P=0.037;P=0.022;P=0.003),與患者性別、年齡無關(guān)(P=0.604;P=0.904);ESCC組織中c-MYC蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P=0.019;P=0.023;P=0.005;P=0.001),與患者性別、年齡無關(guān)(P=0.403;P=0.747)。第二部分GRHL3對(duì)食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究目的:研究GRHL3對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,并探討相關(guān)機(jī)制。方法:1應(yīng)用q RT-PCR方法檢測(cè)GRHL3在TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五種食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況,篩選出GRHL3高表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞KYSE30。應(yīng)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)方法敲低GRHL3 m RNA的表達(dá),分為干擾組(si-GRHL3組),陰性對(duì)照組(NC-GRHL3組)及空白對(duì)照組(Con組),經(jīng)q RT-PCR和Western blot方法分別檢測(cè)3組細(xì)胞GRHL3在基因和蛋白水平的表達(dá)情況。2應(yīng)用MTS法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低GRHL3后KYSE30細(xì)胞增殖活性、遷移能力和侵襲能力的變化。3應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)檢測(cè)敲低GRHL3后對(duì)KYSE30細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響。4應(yīng)用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)敲低GRHL3后對(duì)KYSE30細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1檢測(cè)TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五種人食管鱗癌細(xì)胞株GRHL3 m RNA的表達(dá)水平,篩選出GRHL3表達(dá)水平最高的KYSE30細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與NC-GRHL3組和Con組相比,si-GRHL3組KYSE30細(xì)胞中GRHL3基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05),說明已成功敲低GRHL3在KYSE30細(xì)胞中的表達(dá)。2細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示,敲低GRHL3能夠抑制食管癌KYSE30細(xì)胞的克隆形成能力[(59.28士3.64)vs.(87.33士1.90)vs.(88.87士0.36),P0.05]及增殖活性[(0.87士0.01)、(1.22士0.03)、(1.37士0.25)vs.(1.10士0.01)、(1.89士0.09)、(2.10士0.09)vs.(1.14士0.04)、(1.93士0.01)、(2.23士0.05),P0.05)]。3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,劃痕12h和24h后,si-GRHL3組細(xì)胞遷移距離為(24.5±3.2 vs.55.4±4.8)μm,NC-GRHL3組細(xì)胞遷移距離為(59.3±3.6 vs.95.1±4.6)μm,Con組細(xì)胞遷移距離為(64.2±3.2 vs.92.3±3.5)μm。si-GRHL3組遷移距離在12h及24h后與NC-GRHL3組和Con組相比均明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),NC-GRHL3組和Con組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明GRHL3能夠影響KYSE30細(xì)胞的遷移能力。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,si-GRHL3組、NC-GRHL3組和Con組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(50.26±4.37)vs.(120.00±4.01)vs.(129.38±5.20),si-GRHL3組穿膜細(xì)胞數(shù)較NC-GRHL3組和Con組均顯著降低(P0.05),兩者穿膜細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明GRHL3敲低后能夠抑制KYSE30細(xì)胞的侵襲能力。4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與NC-GRHL3組和Con組相比,si-GRHL3組細(xì)胞中DNA合成受到抑制,阻止si-GRHL3組細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,使G0/G1期百分比明顯增加[(66.64士1.31)%vs.(56.53士2.15)%vs.(55.97士1.36)%,P0.05]。敲低GRHL3后,si-GRHL3組KYSE30細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5 Western blot結(jié)果顯示,敲低GRHL3能夠促進(jìn)E鈣粘蛋白(E-cadherin,E-cad)的表達(dá)(P0.05),降低N鈣粘蛋白(N-cadherin,N-cad)的表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1 ESCC患者組織中GRHL3和c-MYC呈高表達(dá)狀態(tài),與腫瘤分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期相關(guān),與患者性別、年齡無關(guān)。2通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)證明GRHL3通過影響食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力及EMT促進(jìn)食管癌的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

HL3 基因和 c-MYC 基因在食管鱗癌組織和癌旁組織NA expressions of GRHL3 and c-MYC in tumor inoma tissues of ESCC patients Para: Para-carcinoma tiss1 vs. para-carcinoma tissues

20 GRHL3 蛋白在食管鱗癌組織和癌旁組織中的ion of GRHL3 protein in tumor tissues andC patients (SP, ×200) A: Positive staining of Gative staining of GRHL3 in para-carcinoma tisoma tissues;
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Danielle Queiroz Calcagno;Mariana Ferreira Leal;Paulo Pimentel Assumpo;Marília de Arruda Cardoso Smith;Rommel Rodríguez Burbano;;MYC and gastric adenocarcinoma carcinogenesis[J];World Journal of Gastroenterology;2008年39期

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本文編號(hào)：2579165