【摘要】：研究背景結(jié)直腸癌是人類(lèi)常見(jiàn)消化道惡性腫瘤。發(fā)病率和死亡率均位列腫瘤譜前列。而結(jié)直腸癌治療失敗的原因主要是由于術(shù)后的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā),而在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移事件中,肝臟是最主要的轉(zhuǎn)移部位。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)受多基因、多步驟調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的發(fā)病或者轉(zhuǎn)移相關(guān)。本課題組前期通過(guò)對(duì)一個(gè)患者的腸道正常組織、腺瘤和腺癌組織進(jìn)行全外顯子高通量深度測(cè)序,發(fā)現(xiàn)在腺瘤樣本中存在CDH20基因突變,且腺瘤和腺癌樣本的CDH20表達(dá)降低。既往也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)CDH20基因在乳腺癌和食管癌中的突變或缺失。提示在結(jié)直腸癌的發(fā)展過(guò)程中,CDH20基因具有相關(guān)未知的作用。CDH20是以E-鈣粘蛋白為代表的鈣粘蛋白超家族中的一員,已有大量的研究證明,鈣粘蛋白超家族是一個(gè)與腫瘤密切相關(guān)的蛋白家族,而E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白也是細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白,參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前CDH20與腫瘤的關(guān)系還不明確,在結(jié)直腸癌中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該基因可能參與了結(jié)直腸癌發(fā)生或發(fā)展的過(guò)程,而其具體功能尚未闡明。本課題對(duì)其進(jìn)行更加全面的研究,以期更加深入的了解CDH20在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用,從機(jī)制明確其潛在的臨床意義,以及CDH20在干預(yù)阻斷轉(zhuǎn)移中具有的潛在作用,提供判斷轉(zhuǎn)移、預(yù)測(cè)預(yù)后的潛在分子標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)方法Ⅰ CDH20與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析收集臨床結(jié)直腸癌癌和癌旁組織標(biāo)本53例,提取標(biāo)本組織總RNA,利用RT-qPCR法檢測(cè)標(biāo)本中CDH20的相對(duì)表達(dá)并與臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析。ⅡCDH20基因功能的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究體外實(shí)驗(yàn)1、使用RT-qPCR和Western Blot來(lái)評(píng)價(jià)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中CDH20的表達(dá),包括SW620、SW480、LoVo、RKO、HCT116、HT29、CT26, SW1116細(xì)胞系。2、構(gòu)建慢病毒CDH20高表達(dá)和CDH20敲除的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸癌SW1116-CDH20、SW1116-shCDH20細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系。3、.體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光觀察CDH20蛋白在細(xì)胞中的位置,MTT增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)研究CDH20在增殖和遷移侵襲中的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)向裸鼠脾臟包膜內(nèi)注射高表達(dá)CDH20細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞系后切脾進(jìn)行肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。機(jī)制研究5、通過(guò)RT-qPCR和Western Blot來(lái)檢測(cè)CDH20高表達(dá)及敲除后細(xì)胞系的EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況,以研究CDH20對(duì)EMT過(guò)程的影響。6、通過(guò)免疫熒光、免疫共沉淀和Western Blot以說(shuō)明β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細(xì)胞內(nèi)的定位及和CDH20的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果I CDH20與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析CDH20在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)陽(yáng)性和肝轉(zhuǎn)移患者癌組織中表達(dá)明顯低于淋巴結(jié)陰性及無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者,而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)明顯相關(guān)性。提示CDH20在結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用；II CDH20基因功能的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究體外實(shí)驗(yàn)：1、CDH20定位于細(xì)胞膜,通過(guò)慢病毒所介導(dǎo)CDH20高表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)及增殖能力無(wú)明顯影響。2、CDH20可增加腫瘤細(xì)胞與纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)的粘附能力,并顯著降低腫瘤細(xì)胞體外遷移和侵襲能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：3、裸鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDH20高表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的肝臟轉(zhuǎn)移能力。機(jī)制研究：4、上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白和β-連環(huán)蛋白在CDH20高表達(dá)時(shí)表達(dá)升高,而間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)則明顯降低,提示CDH20能抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程。5、β-catenin增高后未在核內(nèi)聚積,可能直接與細(xì)胞膜上的CDH20結(jié)合。結(jié)論1、CDH20在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)陽(yáng)性和肝轉(zhuǎn)移患者癌組織中低表達(dá),而與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)明顯相關(guān)性。2、CDH20高表達(dá)未改變SW1116細(xì)胞體外基質(zhì)膠培養(yǎng)上培養(yǎng)形態(tài),對(duì)細(xì)胞體外增殖能力無(wú)明顯影響；3、CDH20主要表達(dá)于細(xì)胞膜,能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞系SW1116與纖維連接蛋白(FN)之間的粘附能力；4、CDH20能夠增強(qiáng)E-鈣粘蛋白和p-連環(huán)蛋白的表達(dá),同時(shí)抑制N-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá),抑制大腸癌細(xì)胞的體外遷移、侵襲能力,抑制EMT過(guò)程；CDH20高表達(dá)后能顯著降低體內(nèi)腫瘤細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移的能力。
【圖文】：

ｃａｎｃ色ｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邐ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑圖２．２邋ＲＴ－ｑＰＣ民檢測(cè)ＣＤＨ２０在結(jié)直腸癌癌組織和癌旁組織的相對(duì)衷達(dá)量。癌逡逑１５逡逑

邐完整逡逑a黈逡逑圖２．１樣本ＲＮＡ凝膠電泳圖（部分樣本示意）逡逑２．３．２邋５３例結(jié)直腸癌患者ＣＤＨ２０邋ＲＴ－ｑＰＣＲ結(jié)果逡逑１００］邐？逡逑0邐？逡逑．哀邋８０－逡逑0邐？邐？逡逑Ｉ邐．逡逑０）邋６０－逡逑０）邐一邐？？逡逑含邐？邐？逡逑皂邐４０－邐．邐．逡逑0邐？？？邐＊？？逡逑°邐：？邐？？逡逑Ｓ邋２０－邐—＾邐—逡逑０１邐？？？？＜作．公．．邐？＞．ｙｇｙｆｒ？、．．逡逑ｃａｎｃ色ｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邐ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑圖２．２邋ＲＴ－ｑＰＣ民檢測(cè)ＣＤＨ２０在結(jié)直腸癌癌組織和癌旁組織的相對(duì)衷達(dá)量。癌逡逑１５逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2579251