【摘要】：研究目的各種外源性因素例如電離輻射(ionizing radiation, IR)、紫外線及化療藥物和內源性因素例如代謝產(chǎn)物及活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)等均可造成DNA不同形式的損傷,諸如復制叉停滯、DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂等(double strands breaks, DSBs)。DSBs是DNA最嚴重的損傷形式之一,它可導致染色體重排、腫瘤的發(fā)生和細胞死亡等。在應答DNA損傷時,有兩種主要機制參與]ONADSBs修復：同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端鏈接(non-homologous end joining, NHEJ)。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility genel, BRCA1)是調控HR修復DSBs的重要蛋白。p53作為重要的腫瘤抑制因子也參與包括細胞周期停滯、細胞凋亡、轉錄調控和DNA損傷修復等一系列細胞活動。相關研究表明,p53和BRCA1都參與細胞增殖和DNA修復過程中轉錄調控,但是兩種蛋白在IR致DNA DSBs修復中的相互作用,尤其是在協(xié)同調控HR修復的分子機制中的作用目前仍不清楚。本課題通過乳腺癌腫瘤細胞中p53和BRCA1功能狀態(tài)對細胞DSBs修復、放射敏感性和維持細胞基因穩(wěn)定性等方面作用的研究,以探討p53和BRCA1功能關聯(lián)性在調控HR修復過程中的作用。p53和BRCA1功能關聯(lián)性在HR分子機制中作用的闡明,對揭示HR修復的分子機制及腫瘤的發(fā)生都將具有重要的意義。研究方法1.細胞系工作模型的建立應用HPV-E6和LXSN逆轉錄病毒顆粒感染含有野生型p53(wild type p53,wtp53)MCF7細胞,建立p53表達下調的MCF7/E6和表達wtp53的MCF7/LXSN同源配對細胞系；用pLKO-1和P53shRNA病毒顆粒感染MCF7細胞建立p53表達下調的同源配對細胞系；轉染HR底物報告基因pDR-GFP至MCF7細胞,建立表達pDR-GFP的MCF7/pDR-GFP細胞系。2.p53和BRCA1表達的檢測分別用HPV-E6病毒感染wtp53的MCF7細胞降解p53,或者用shRNA沉默MCF7細胞中p53表達,無IR或給予10Gy電離輻射后8h,用RT-qPCR法檢測p53和BRCA1的:mRNA水平變化,用蛋白免疫印跡法觀察p53、BRCA1、p21等蛋白的表達情況,用免疫熒光法觀察BRCA1、Rad51等蛋白焦點形成的動態(tài)變化。用shRNA沉默MCF7細胞中BRCA1表達,無IR或給予10Gy電離輻射后8h,通過蛋白免疫印跡法觀察p53、BRCA1等蛋白的表達情況。3.p53和BRCA1蛋白水平相互作用的測定轉染wtp53進入H1299細胞,通過免疫共沉淀實驗觀察p53和BRCA1在蛋白水平上的相互作用。4.HR修復效率的測定用HPV-E6病毒感染MCF7/pDR-GFP細胞降解p53、或用shRNA沉默MCF7/pDR-GFP細胞中p53的表達以及下調p53后再轉染wtp53以恢復p53的表達,在上述不同條件下通過流式細胞術測定自發(fā)HR(spontaneous homologous recombination, SR)效率和核酸酶I-SceI誘導的HR效率。5.細胞周期的檢測HPV-E6病毒感染MCF7細胞、或用p53的shRNA沉默MCF7細胞中p53表達、以及下調p53后再轉染wtp53以恢復p53表達,然后在無IR或給予10Gy電離輻射后,收集細胞,0.1%TritonX-100處理、冰乙醇固定和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色后,通過流式細胞術檢測細胞周期。6.應用克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性分別用HPV-E6病毒或者BRCA1的shRNA作用于對數(shù)生長期的MCF7細胞,分別給予0、2、4和6Gy不同劑量電離輻射照射,繼續(xù)培養(yǎng)三周,甲醇固定和結晶紫染色后,計數(shù)細胞克隆形成數(shù),并計算克隆形成數(shù)。7.應用熒光原位雜交實驗檢測細胞染色體穩(wěn)定性分別用HPV-E6病毒或者BRCA1的shRNA作用于MCF7細胞,給予0Gy或2Gy電離輻射照射后24小時,應用肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)探針通過熒光原位雜交實驗(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測細胞染色單體和染色體斷裂、及輻射狀染色體異常結構形成。研究結果1.成功建立細胞系工作模型蛋白免疫印跡法結果顯示,含HPV-E6或p53shRNA病毒顆粒感染MCF7細胞后,與對照組細胞系中p53表達相比,MCF7/E6和p53shRNA細胞系中p53和p21表達量明顯降低；用轉染wtp53方法恢復p53的表達,p53誘導的p21表達量又有所增加,提示成功建立了兩對p53缺欠同源配對細胞系。流式細胞術結果顯示,也成功篩選出表達同源重組底物pDR-GFP的MCF7細胞,建立MCF7/pDR-GFP細胞系。2.應答DNA損傷時,p53抑制過度重組修復流式細胞術檢測HR的結果顯示,應用HPV-E6和p53的shRNA分別降解和沉默MCF7/pDR-GFP細胞系中的p53表達后,與對照組相比,SR效率和I-SceI誘導的HR效率都進一步顯著增加(p0.01)；當p53缺欠的MCF7細胞被轉染表達wtp53質粒后,I-SceI誘導增加的HR效率又發(fā)生明顯的降低(p0.01)。3.p53抑制DNA損傷位點Rad51的過度募集免疫熒光實驗結果顯示,HPV-E6感染MCF7細胞后,未給予IR照射時,Rad51蛋白焦點形成細胞百分比從5.3%顯著增加至21.9%(p0.05)；10Gy電離輻射照射后8h,IR誘導的Rad51蛋白焦點形成細胞百分比從45.7%進一步顯著增加至71.0%(p0.05)。10Gy電離輻射照射后8h內各時間點,與對照組比較,shRNA沉默p53表達后Rad51蛋白焦點形成的細胞百分比都相應地顯著增加。4.p53通過調節(jié)BRCA1活性以調控HR修復分子機制蛋白免疫印跡法結果顯示,BRCA1的shRNA可成功下調BRCA1在MCF7細胞系中的表達,p53的表達量并未受到影響。但是,下調MCF7細胞中p53表達后BRCA1表達量顯著增加,若進一步恢復wtp53在細胞中的表達,增高的BRCA1的表達量又被降低；同樣,恢復wtp53在H1299細胞中的表達后,細胞中BRCA1表達量明顯降低。以上實驗研究提示在蛋白水平上p53能夠抑制BRCA1過度表達。免疫熒光實驗結果進一步顯示,HPV-E6;感染MCF7細胞后,未給予IR時,BRCA1蛋白焦點形成細胞百分比從31.4%顯著增加至50.8%(p0.05)；10Gy電離輻射照射后8h,IR誘導的BRCA1蛋白焦點形成細胞百分比從51.4%也進步顯著增加至78.6%(p0.05)。shRNA沉默p53表達后10Gy電離輻射照射后8h內各時間點與對照比較,BRCA1蛋白焦點形成的細胞百分比均相應地顯著增加(p0.05)。以上實驗研究提示p53能夠抑制BRCA1在DNA損傷區(qū)域的過度募集。免疫共沉淀實驗結果顯示,p53和BRCA1兩種蛋白之間有相互作用,并且存在于同一蛋白質復合物沉淀中。RT-qPCR實驗結果顯示,shRNA沉默MCF7細胞中p53表達后,BRCA1的mRNA水平顯著升高(p0.01),再恢復wtp53表達后,增高的BRCA1的mRNA水平表達又明顯降低(p0.01)。以上實驗研究提示在轉錄水平上p53可抑制BRCA1 mRNA表達。5.在BRCA1表達缺欠細胞中,p53表達下調還能恢復HR效率細胞流式細胞術結果顯示,在BRCA1表達正常細胞中,HPV-E6降解p53后,細胞SR效率和I-Scel誘導的HR效率分別增加了2倍和5倍(p0.01);在BRCA1表達缺欠細胞中,再下調p53表達后,降低的HR又得以恢復。6.p53與BRCA1功能相關性對細胞的輻射抵抗性的影響克隆形成實驗結果顯示,在2、4和6Gy電離輻射處理MCF7細胞后,與正常對照組相比較,用HPV-E6病毒下調p53表達可顯著增加細胞對輻射的抵抗性(p0.01)：用BRCA1 shRNA下調BRCA1表達則可增加細胞對輻射的敏感性(p0.01)。在BRCA1表達缺欠細胞中,進一步滅活p53功能,發(fā)現(xiàn)2Gy和4Gy電離輻射照射細胞后,細胞對輻射抵抗性又增強,使對輻射敏感的細胞又變得不敏感(p0.01),但6Gy處理組細胞的敏感性沒有明顯變化(p0.05)。7.p53與BRCA1功能相關性對染色體穩(wěn)定性的影響FISH結果顯示,當未給予IR時,p53表達缺欠的MCF7細胞中自發(fā)性的染色單體斷裂、染色體斷裂和輻射狀染色體異常結構形成等無明顯變化(p0.01),但是,BRCA1表達缺欠細胞中的染色體斷裂和輻射狀染色體異常結構形成顯著增加(p0.01)。IR照射細胞后,p53表達下調使IR誘導的染色體斷裂和輻射狀染色體異常結構形成明顯減少,而BRCA1缺欠則使染色體異常結構形成明顯增多；但在BRCA1表達缺欠的細胞中,進一步下調p53表達后,自發(fā)和IR誘導的染色單體斷裂、染色體斷裂和輻射狀染色體異常結構形成均有所減少。該項指標變化與HR效率、細胞對輻射敏感性等結果相一致。研究結論1.p53可抑制Rad51介導的過度重組修復。2.p53可在轉錄水平上抑制BRCA1功能過強,在調控HR的分子機制中p53和BRCA1之間存在功能關聯(lián)性。3.p53與BRCA1功能相關性可影響細胞輻射抵抗性和染色體穩(wěn)定性。4.p53還可不依賴于BRCA1通路抑制HR修復分子機制。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2

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