【摘要】：研究目的各種外源性因素例如電離輻射(ionizing radiation, IR)、紫外線及化療藥物和內(nèi)源性因素例如代謝產(chǎn)物及活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)等均可造成DNA不同形式的損傷,諸如復(fù)制叉停滯、DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂等(double strands breaks, DSBs)。DSBs是DNA最嚴(yán)重的損傷形式之一,它可導(dǎo)致染色體重排、腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞死亡等。在應(yīng)答DNA損傷時(shí),有兩種主要機(jī)制參與]ONADSBs修復(fù)：同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端鏈接(non-homologous end joining, NHEJ)。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility genel, BRCA1)是調(diào)控HR修復(fù)DSBs的重要蛋白。p53作為重要的腫瘤抑制因子也參與包括細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等一系列細(xì)胞活動(dòng)。相關(guān)研究表明,p53和BRCA1都參與細(xì)胞增殖和DNA修復(fù)過(guò)程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控,但是兩種蛋白在IR致DNA DSBs修復(fù)中的相互作用,尤其是在協(xié)同調(diào)控HR修復(fù)的分子機(jī)制中的作用目前仍不清楚。本課題通過(guò)乳腺癌腫瘤細(xì)胞中p53和BRCA1功能狀態(tài)對(duì)細(xì)胞DSBs修復(fù)、放射敏感性和維持細(xì)胞基因穩(wěn)定性等方面作用的研究,以探討p53和BRCA1功能關(guān)聯(lián)性在調(diào)控HR修復(fù)過(guò)程中的作用。p53和BRCA1功能關(guān)聯(lián)性在HR分子機(jī)制中作用的闡明,對(duì)揭示HR修復(fù)的分子機(jī)制及腫瘤的發(fā)生都將具有重要的意義。研究方法1.細(xì)胞系工作模型的建立應(yīng)用HPV-E6和LXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染含有野生型p53(wild type p53,wtp53)MCF7細(xì)胞,建立p53表達(dá)下調(diào)的MCF7/E6和表達(dá)wtp53的MCF7/LXSN同源配對(duì)細(xì)胞系；用pLKO-1和P53shRNA病毒顆粒感染MCF7細(xì)胞建立p53表達(dá)下調(diào)的同源配對(duì)細(xì)胞系；轉(zhuǎn)染HR底物報(bào)告基因pDR-GFP至MCF7細(xì)胞,建立表達(dá)pDR-GFP的MCF7/pDR-GFP細(xì)胞系。2.p53和BRCA1表達(dá)的檢測(cè)分別用HPV-E6病毒感染wtp53的MCF7細(xì)胞降解p53,或者用shRNA沉默MCF7細(xì)胞中p53表達(dá),無(wú)IR或給予10Gy電離輻射后8h,用RT-qPCR法檢測(cè)p53和BRCA1的:mRNA水平變化,用蛋白免疫印跡法觀察p53、BRCA1、p21等蛋白的表達(dá)情況,用免疫熒光法觀察BRCA1、Rad51等蛋白焦點(diǎn)形成的動(dòng)態(tài)變化。用shRNA沉默MCF7細(xì)胞中BRCA1表達(dá),無(wú)IR或給予10Gy電離輻射后8h,通過(guò)蛋白免疫印跡法觀察p53、BRCA1等蛋白的表達(dá)情況。3.p53和BRCA1蛋白水平相互作用的測(cè)定轉(zhuǎn)染wtp53進(jìn)入H1299細(xì)胞,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察p53和BRCA1在蛋白水平上的相互作用。4.HR修復(fù)效率的測(cè)定用HPV-E6病毒感染MCF7/pDR-GFP細(xì)胞降解p53、或用shRNA沉默MCF7/pDR-GFP細(xì)胞中p53的表達(dá)以及下調(diào)p53后再轉(zhuǎn)染wtp53以恢復(fù)p53的表達(dá),在上述不同條件下通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定自發(fā)HR(spontaneous homologous recombination, SR)效率和核酸酶I-SceI誘導(dǎo)的HR效率。5.細(xì)胞周期的檢測(cè)HPV-E6病毒感染MCF7細(xì)胞、或用p53的shRNA沉默MCF7細(xì)胞中p53表達(dá)、以及下調(diào)p53后再轉(zhuǎn)染wtp53以恢復(fù)p53表達(dá),然后在無(wú)IR或給予10Gy電離輻射后,收集細(xì)胞,0.1%TritonX-100處理、冰乙醇固定和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。6.應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性分別用HPV-E6病毒或者BRCA1的shRNA作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞,分別給予0、2、4和6Gy不同劑量電離輻射照射,繼續(xù)培養(yǎng)三周,甲醇固定和結(jié)晶紫染色后,計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù),并計(jì)算克隆形成數(shù)。7.應(yīng)用熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞染色體穩(wěn)定性分別用HPV-E6病毒或者BRCA1的shRNA作用于MCF7細(xì)胞,給予0Gy或2Gy電離輻射照射后24小時(shí),應(yīng)用肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)探針通過(guò)熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測(cè)細(xì)胞染色單體和染色體斷裂、及輻射狀染色體異常結(jié)構(gòu)形成。研究結(jié)果1.成功建立細(xì)胞系工作模型蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,含HPV-E6或p53shRNA病毒顆粒感染MCF7細(xì)胞后,與對(duì)照組細(xì)胞系中p53表達(dá)相比,MCF7/E6和p53shRNA細(xì)胞系中p53和p21表達(dá)量明顯降低；用轉(zhuǎn)染wtp53方法恢復(fù)p53的表達(dá),p53誘導(dǎo)的p21表達(dá)量又有所增加,提示成功建立了兩對(duì)p53缺欠同源配對(duì)細(xì)胞系。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,也成功篩選出表達(dá)同源重組底物pDR-GFP的MCF7細(xì)胞,建立MCF7/pDR-GFP細(xì)胞系。2.應(yīng)答DNA損傷時(shí),p53抑制過(guò)度重組修復(fù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HR的結(jié)果顯示,應(yīng)用HPV-E6和p53的shRNA分別降解和沉默MCF7/pDR-GFP細(xì)胞系中的p53表達(dá)后,與對(duì)照組相比,SR效率和I-SceI誘導(dǎo)的HR效率都進(jìn)一步顯著增加(p0.01)；當(dāng)p53缺欠的MCF7細(xì)胞被轉(zhuǎn)染表達(dá)wtp53質(zhì)粒后,I-SceI誘導(dǎo)增加的HR效率又發(fā)生明顯的降低(p0.01)。3.p53抑制DNA損傷位點(diǎn)Rad51的過(guò)度募集免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HPV-E6感染MCF7細(xì)胞后,未給予IR照射時(shí),Rad51蛋白焦點(diǎn)形成細(xì)胞百分比從5.3%顯著增加至21.9%(p0.05)；10Gy電離輻射照射后8h,IR誘導(dǎo)的Rad51蛋白焦點(diǎn)形成細(xì)胞百分比從45.7%進(jìn)一步顯著增加至71.0%(p0.05)。10Gy電離輻射照射后8h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn),與對(duì)照組比較,shRNA沉默p53表達(dá)后Rad51蛋白焦點(diǎn)形成的細(xì)胞百分比都相應(yīng)地顯著增加。4.p53通過(guò)調(diào)節(jié)BRCA1活性以調(diào)控HR修復(fù)分子機(jī)制蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示,BRCA1的shRNA可成功下調(diào)BRCA1在MCF7細(xì)胞系中的表達(dá),p53的表達(dá)量并未受到影響。但是,下調(diào)MCF7細(xì)胞中p53表達(dá)后BRCA1表達(dá)量顯著增加,若進(jìn)一步恢復(fù)wtp53在細(xì)胞中的表達(dá),增高的BRCA1的表達(dá)量又被降低；同樣,恢復(fù)wtp53在H1299細(xì)胞中的表達(dá)后,細(xì)胞中BRCA1表達(dá)量明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)研究提示在蛋白水平上p53能夠抑制BRCA1過(guò)度表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示,HPV-E6;感染MCF7細(xì)胞后,未給予IR時(shí),BRCA1蛋白焦點(diǎn)形成細(xì)胞百分比從31.4%顯著增加至50.8%(p0.05)；10Gy電離輻射照射后8h,IR誘導(dǎo)的BRCA1蛋白焦點(diǎn)形成細(xì)胞百分比從51.4%也進(jìn)步顯著增加至78.6%(p0.05)。shRNA沉默p53表達(dá)后10Gy電離輻射照射后8h內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照比較,BRCA1蛋白焦點(diǎn)形成的細(xì)胞百分比均相應(yīng)地顯著增加(p0.05)。以上實(shí)驗(yàn)研究提示p53能夠抑制BRCA1在DNA損傷區(qū)域的過(guò)度募集。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p53和BRCA1兩種蛋白之間有相互作用,并且存在于同一蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀中。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,shRNA沉默MCF7細(xì)胞中p53表達(dá)后,BRCA1的mRNA水平顯著升高(p0.01),再恢復(fù)wtp53表達(dá)后,增高的BRCA1的mRNA水平表達(dá)又明顯降低(p0.01)。以上實(shí)驗(yàn)研究提示在轉(zhuǎn)錄水平上p53可抑制BRCA1 mRNA表達(dá)。5.在BRCA1表達(dá)缺欠細(xì)胞中,p53表達(dá)下調(diào)還能恢復(fù)HR效率細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在BRCA1表達(dá)正常細(xì)胞中,HPV-E6降解p53后,細(xì)胞SR效率和I-Scel誘導(dǎo)的HR效率分別增加了2倍和5倍(p0.01);在BRCA1表達(dá)缺欠細(xì)胞中,再下調(diào)p53表達(dá)后,降低的HR又得以恢復(fù)。6.p53與BRCA1功能相關(guān)性對(duì)細(xì)胞的輻射抵抗性的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在2、4和6Gy電離輻射處理MCF7細(xì)胞后,與正常對(duì)照組相比較,用HPV-E6病毒下調(diào)p53表達(dá)可顯著增加細(xì)胞對(duì)輻射的抵抗性(p0.01)：用BRCA1 shRNA下調(diào)BRCA1表達(dá)則可增加細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性(p0.01)。在BRCA1表達(dá)缺欠細(xì)胞中,進(jìn)一步滅活p53功能,發(fā)現(xiàn)2Gy和4Gy電離輻射照射細(xì)胞后,細(xì)胞對(duì)輻射抵抗性又增強(qiáng),使對(duì)輻射敏感的細(xì)胞又變得不敏感(p0.01),但6Gy處理組細(xì)胞的敏感性沒(méi)有明顯變化(p0.05)。7.p53與BRCA1功能相關(guān)性對(duì)染色體穩(wěn)定性的影響FISH結(jié)果顯示,當(dāng)未給予IR時(shí),p53表達(dá)缺欠的MCF7細(xì)胞中自發(fā)性的染色單體斷裂、染色體斷裂和輻射狀染色體異常結(jié)構(gòu)形成等無(wú)明顯變化(p0.01),但是,BRCA1表達(dá)缺欠細(xì)胞中的染色體斷裂和輻射狀染色體異常結(jié)構(gòu)形成顯著增加(p0.01)。IR照射細(xì)胞后,p53表達(dá)下調(diào)使IR誘導(dǎo)的染色體斷裂和輻射狀染色體異常結(jié)構(gòu)形成明顯減少,而BRCA1缺欠則使染色體異常結(jié)構(gòu)形成明顯增多；但在BRCA1表達(dá)缺欠的細(xì)胞中,進(jìn)一步下調(diào)p53表達(dá)后,自發(fā)和IR誘導(dǎo)的染色單體斷裂、染色體斷裂和輻射狀染色體異常結(jié)構(gòu)形成均有所減少。該項(xiàng)指標(biāo)變化與HR效率、細(xì)胞對(duì)輻射敏感性等結(jié)果相一致。研究結(jié)論1.p53可抑制Rad51介導(dǎo)的過(guò)度重組修復(fù)。2.p53可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制BRCA1功能過(guò)強(qiáng),在調(diào)控HR的分子機(jī)制中p53和BRCA1之間存在功能關(guān)聯(lián)性。3.p53與BRCA1功能相關(guān)性可影響細(xì)胞輻射抵抗性和染色體穩(wěn)定性。4.p53還可不依賴于BRCA1通路抑制HR修復(fù)分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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