【摘要】：研究背景食管癌(esophageal cancer,EC)是人類常見惡性腫瘤之一,由于其惡性程度高,5年生存率低于20%,已經(jīng)成為世界上第八大惡性腫瘤。食管癌是我國農(nóng)村發(fā)病率最高的惡性腫瘤,全球每年有約45萬新增病例,中國每年確診的食管癌患者約占全球總數(shù)的一半,并且發(fā)病率仍在逐年升高,其中90%的食管癌病理類型是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。盡管手術及輔助放化療等治療技術明顯進步,但是ESCC總的五年生存率仍然很低。原因在于大多數(shù)ESCC病人被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是腫瘤晚期,不適合做根治性切除術。有研究證實,早期診斷和早期治療可獲得較好的預后。而目前食管癌的早期診斷主要依靠復方碘溶液內(nèi)鏡下黏膜染色檢查,但是其靈敏度、特異性均不理想。人們十分關心腫瘤標記物的研究和開發(fā),希望能夠?qū)ふ业届`敏度高、特異性強的腫瘤標記物。因此,尋找能夠有效用于ESCC早期診斷的腫瘤生物標記物將變得非常緊迫且意義重大。近年來由于分子生物學相關技術的飛速進步,一些與惡性腫瘤病因和發(fā)病機制相關的癌基因和抑癌基因相繼被發(fā)現(xiàn),人們對于惡性腫瘤的認識也在不斷的深化。然而基因的生物學功能并不是通過自己實現(xiàn)的,而是通過編碼的蛋白質(zhì)來執(zhí)行其生物學功能的。因此,蛋白質(zhì)組學相關技術的飛速發(fā)展為發(fā)現(xiàn)腫瘤的特異性蛋白質(zhì)標記物提供新的技術平臺,也為研究惡性腫瘤的病因、發(fā)病機制、治療效果及預后奠定了技術基礎。蛋白質(zhì)是生命活動的實際執(zhí)行者,蛋白質(zhì)組學是生命科學的新亮點,它利用了臨床醫(yī)學、分子生物學、質(zhì)譜分析(MS)和生物信息學等多種不同領域的技術工具,來共同探索和實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的分離、純化和鑒定,它是研究特定組織細胞在不同時空情況下全部蛋白質(zhì)表達和功能的一種高通量平臺技術,能夠動態(tài)、完整和定量地考察疾病發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改變,有助于尋找到疾病診斷和治療的標記物。1997年,Unlu M結(jié)合了蛋白質(zhì)組學研究中經(jīng)典的雙向電泳技術和特有的多重熒光分析技術,研究出一種新的定量蛋白質(zhì)組學技術——雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)。將樣品在雙向電泳之前分別用三種不同熒光染料Cy2,Cy3和Cy5標記。這三種熒光染料帶有相同的活化基團-NHS脂,可以特異性與賴氨酸殘基的ε氨基結(jié)合,由于這三種染料化學結(jié)構(gòu)上相似,分子量接近,帶有一個正電荷,這樣蛋白質(zhì)與熒光染料結(jié)合后其等電點不會發(fā)生改變,保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動到相同的位置。將標記好的蛋白質(zhì)樣品混合,在同一塊膠上進行雙向電泳。并通過多通道激光掃描凝膠圖像得到不同顏色熒光信號,根據(jù)這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。在2D-DIGE技術中,第一次引入了內(nèi)標的概念,每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標,并且軟件全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標對其表達量進行校準,保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的,極大提高了結(jié)果的準確性,重復性和可靠性。2D-DIGE技術是目前蛋白質(zhì)組學研究中可信度和準確率最高的技術之一。近年來,國內(nèi)外學者對有關食管癌早期診斷的分子生物學標記物作了大量有益的研究,有些已經(jīng)應用于臨床實踐。對食管癌患者的普查、早期診斷及預后,目前運用到的腫瘤標記物主要包括:癌胚抗原(CEA)、糖蛋白50(CA50)、糖蛋白242(CA242)、糖蛋白199(CA199)、組織多肽糖原(TPA)、細胞角質(zhì)蛋白(Cyfra21-1)和神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)及甲胎蛋白(AFP)等,但其靈敏度和特異性仍不是非常令人滿意。以往有關癌癥腫瘤標記物的研究主要是利用癌癥及癌旁組織,或者永生化細胞系作為研究對象。然而,血漿是機體中非常重要的組織液,血漿蛋白質(zhì)組的變化能夠在疾病發(fā)生早期來反映機體的健康狀況,并且無痛苦無創(chuàng)傷,樣品收集方便。從血漿中來尋找潛在的腫瘤生物標記物將能夠用于腫瘤的早期診斷,因此,越來越多的研究者熱衷于從外周血中來篩選蛋白標記物。研究目的篩選并鑒定能夠用于食管鱗狀細胞癌早期診斷用的特異性血漿腫瘤標記物,為早期診斷ESCC提供可靠的依據(jù)。材料和方法1.臨床標本53例食管鱗狀細胞癌患者血漿標本均來自2014年3月~2015年3月鄭州大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胸外科住院患者,且均為患者初診時獲得,未經(jīng)手術及放化療等治療。其中ESCC組包括男性31例和女性22例,年齡50~65歲,TNM分期為Tis-T1N0M0,病理學確診為食管鱗狀細胞癌。同時,隨機抽取53例正常健康組的血漿標本,這些標本均來自于2015年1月鄭州大學一附院體檢科健康體檢者,其中包括男性26例和女性27例,年齡50~65歲。本實驗經(jīng)本院倫理委員會同意,且受試者均簽署了知情同意書。所有的血漿標本晨起空腹抽血,室溫靜置1小時,3000r/min離心15min,取上清液,保存于-80℃深低溫冰箱中備用。2.主要儀器和試劑SIGMA Proteo Prep Blue Albumin and Ig G Depletion Kit試劑盒、2-D Clean-up Kit試劑盒、EttanTM 2-D Quant Kit試劑盒、固相化24 cm非線性干膠條、EttanTM IPGPhor等電聚焦儀、Typhoon Imager 9400成像儀、Image Quant TL軟件、De Cyder 2D差異分析軟件、De Cyder V6.5分析軟件、EttanTM DALT Six垂直電泳系統(tǒng)、ABI 4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀。3.蛋白質(zhì)定量應用SIGMA Proteo Prep Blue Albumin and Ig G Depletion Kit試劑盒對血漿樣品進行處理,去除白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白,使低豐度蛋白顯影增強。其他干擾血漿雙向電泳的物質(zhì)用2-D Clean-up Kit試劑盒去除,血漿樣本中的蛋白質(zhì)濃度用EttanTM 2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒測定。4.雙向熒光差異凝膠電泳制作分析膠隨機抽取4例ESCC組血漿標本及4例健康對照組血漿標本各50μg,用Cy3或Cy5熒光染料進行標記反應。內(nèi)標由樣品蛋白各取25混合而成,用Cy2染料進行標記反應。熒光染料標記的血漿蛋白上樣到固相化的非線性干膠條進行水化反應。然后應用EttanTM IPGPhor等電聚焦儀和EttanTM DALT Six垂直電泳系統(tǒng)分別進行第一向和第二向電泳制作分析膠。5.制作制備膠按照分析膠的制備步驟和參數(shù),用膠體考染法進行蛋白染色,將含有同等量的各組樣品蛋白混合后取800μg制作制備膠。6.篩選差異蛋白質(zhì)點用波長488 nm、532 nm、633 nm的激發(fā)光分別對Cy2、Cy3及Cy5進行掃描,用Typhoon多功能掃描成像系統(tǒng)采集分析膠圖像,可以看到Cy2、Cy3及Cy5熒光染料標記的樣本圖像顯色分別為藍色、綠色和紅色。用De Cyder V6.5分析軟件對分析膠蛋白點進行檢測和匹配,配合三維圖像及人工校對,篩選出感興趣的差異蛋白點,然后在制備膠上匹配到相對應的蛋白點,最后使用EttanTM Spot picker全自動斑點切取系統(tǒng)對差異蛋白點進行挖取。7.差異蛋白質(zhì)的分離和純化用胰蛋白酶對挖取的差異蛋白進行膠內(nèi)膠粒,將酶解后的肽段用真空冷凍干燥儀凍干,然后將凍干后的酶解肽段用Zip Tip試劑進行純化和濃縮。8.差異蛋白質(zhì)的鑒定將純化濃縮的樣品點到清潔干燥的MALDI樣品靶上,點好的樣品靶輸入質(zhì)譜分析儀中進行質(zhì)譜分析。首先進行內(nèi)標校正,用強度為3000-4000的激光轟擊樣品,獲取肽質(zhì)量指紋圖譜,然后自動選擇最強的10個母離子,用MS-MS 1KV陽離子獲取及處理方式進行MS/MS二級質(zhì)譜分析,從而得到肽序列標簽。最后將獲取的肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列標簽與蛋白質(zhì)序列比對的非冗余數(shù)據(jù)庫(NCBInr數(shù)據(jù)庫)進行比對,鑒定出高度可信的差異蛋白質(zhì)。9.差異蛋白質(zhì)的生物信息學分析取高度可信的蛋白結(jié)果進行下一步的生物信息學分析。首先根據(jù)蛋白質(zhì)的分子功能對這些差異蛋白進行GO分類,然后利用String蛋白質(zhì)相互作用預測數(shù)據(jù)庫來對差異蛋白進行相互作用預測。10.Western blot驗證隨機選取4例ESCC組血漿標本和4例健康對照組血漿標本,進行Western-blot驗證實驗。11.ELISA驗證隨機抽取45例ESCC組血漿標本及45例健康對照組血漿標本,來進行ELISA驗證實驗。12.統(tǒng)計學方法所使用的統(tǒng)計分析軟件為SPSS 17.0,方差齊性檢驗采用Levene檢驗,兩獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗,取α=0.05作為差別具有統(tǒng)計學意義的檢驗標準。所有的計量資料均使用均數(shù)±標準誤(x±SE)來表示。結(jié)果1.蛋白定量結(jié)果本實驗先用EttanTM 2-D Quant Kit試劑盒進行蛋白定量,然后再通過蛋白染色進行驗證該方法的準確性。每組隨機抽取一個500μg的血漿樣本上樣跑SDS-PAGE電泳并且進行考馬斯亮藍染色,結(jié)果顯示兩組的蛋白條帶灰度值基本一致,表明該定量方法準確可靠。2.分析膠的熒光圖像采集經(jīng)過雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)、Typhoon Imager 9400成像儀熒光掃描及Image Quant TL分析軟件分析,4塊分析膠均得到了清晰的蛋白質(zhì)表達譜,不同染料標記的樣本顏色不同,Cy2的圖像為藍色、Cy3的圖像為綠色、Cy5的圖像為紅色。3.分析出的差異蛋白點用De Cyder V6.5分析軟件進行蛋白點的檢測和匹配,配合三維圖像及人工校對等方法,食管鱗狀細胞癌組血漿蛋白與健康對照組相比較,共篩選到了31個差異蛋白點,其中上調(diào)的蛋白點有16個,下調(diào)的蛋白點有15個。4.差異蛋白點的質(zhì)譜鑒定經(jīng)過膠內(nèi)酶解,用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對31個差異蛋白點進行質(zhì)譜分析,將獲取的肽質(zhì)量指紋圖譜和肽序列標簽與蛋白質(zhì)序列比對的非冗余數(shù)據(jù)庫(NCBInr數(shù)據(jù)庫)進行比對,去除結(jié)果相同的蛋白質(zhì),共鑒定出12種差異蛋白質(zhì),表達上調(diào)的蛋白和表達下調(diào)的蛋白各6種。表達上調(diào)的蛋白為α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS-糖蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、鋅-α2-糖蛋白、補體因子I、補體C4B;表達下調(diào)的蛋白為血清白蛋白、免疫球蛋白的α2鏈C區(qū)、α-1抗胰蛋白酶、纖維蛋白原γ鏈、觸珠蛋白、血紅蛋白α亞基。5.按照分子功能對差異蛋白進行GO分類按照差異蛋白的分子功能對這些差異蛋白進行GO分類,可以大概把這些蛋白質(zhì)歸為以下四類,分別是炎癥反應、免疫反應、轉(zhuǎn)運蛋白和凝血等生理功能相關的蛋白質(zhì)。其中占比例最大的是炎癥反應相關蛋白和免疫反應蛋白,分別為38.7%和29%,轉(zhuǎn)運蛋白和凝血蛋白占的比例分別是19.4%和12.9%。6.差異蛋白質(zhì)的相互作用分析利用String蛋白質(zhì)相互作用預測數(shù)據(jù)庫來對差異蛋白進行相互作用預測,除了IGHA2、SERPINA3和C4B外,其他9種蛋白有可能存在直接或者間接的相互作用。13.Western blot驗證結(jié)果Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),AHSG和LRG在ESCC患者血漿中濃度均明顯高于健康志愿者。AHSG灰度值的平均值在ESCC組升高約2.8倍左右,LRG灰度值的平均值在ESCC組升高約1.8倍左右。因此,ESCC組血漿中AHSG和LRG的WB驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)組學結(jié)果是一致的。8.ELISA驗證結(jié)果ELISA實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),AHSG和LRG在食管鱗狀細胞癌患者(n=45)血漿中濃度均明顯高于健康志愿者,與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。AHSG在健康對照組的濃度為140.9±27.3μg/ml(x±SE),在ESCC患者組血漿中濃度為308.4±62.3μg/ml(x±SE)。LRG在健康對照組的濃度為45.3±9.4μg/ml(x±SE),在ESCC患者組血漿中濃度為118.1±24.3μg/ml(x±SE)。Levene方差齊性檢驗顯示兩組數(shù)據(jù)方差齊性,采用兩獨立樣本t檢驗,P0.05,ESCC組和健康對照組血漿相比,AHSG和LRG的濃度均存在顯著性差異。結(jié)論1.利用差異蛋白質(zhì)組學平臺共篩選出12種與ESCC早期診斷相關的血漿差異蛋白質(zhì),這些差異蛋白有可能成為潛在的血漿腫瘤標志物;2.α2-HS-糖蛋白和富含亮氨酸的α2糖蛋白有可能成為ESCC潛在的血漿腫瘤標記物,為ESCC的早期診斷提供新的機遇,但是仍需要擴大樣本量來確定其敏感度和特異性;3.α2-HS-糖蛋白和富含亮氨酸的α2糖蛋白可能與ESCC的發(fā)病機制關系密切,尚待進一步研究;4.本實驗聯(lián)合應用了2D-DIGE技術,MALDI TOF/TOF質(zhì)譜分析技術和生物信息學分析技術等比較蛋白質(zhì)組學技術,為腫瘤標記物的篩選與鑒定提供了有效的技術支持。
【圖文】：

1.2.6 分析膠的掃描成像用波長488 nm、532 nm、633 nm的激發(fā)光分別對Cy2、Cy3及Cy5進行掃描，用Typhoon多功能掃描成像系統(tǒng)采集分析膠圖像。通過ImageQuant TL軟件可以看到Cy2、Cy3及Cy5熒光染料標記的樣本圖像顯色分別為藍色、綠色和紅色。具體DIGE基本工作流程見圖1-1。

1.2.14 統(tǒng)計學方法所使用的統(tǒng)計分析軟件為 SPSS 17.0，所有的計量資料均使用均數(shù)±標x±SE）來表示。方差齊性檢驗采用 Levene 檢驗，兩獨立樣本均數(shù)比較驗，取 α=0.05 作為差別具有統(tǒng)計學意義的檢驗標準。1.3 結(jié)果1.3.1 蛋白定量結(jié)果本實驗先用EttanTM2-D Quant Kit 試劑盒進行蛋白定量，，然后再通過蛋進行驗證該方法的準確性。本實驗取兩個蛋白總量均為500 μg的不同組樣品進行SDS-PAGE電泳并且考馬斯亮藍染色，圖1-2是2-D Quant kit定量的標準曲線及考馬斯亮藍染色驗證，結(jié)果顯示在測量范圍內(nèi)呈較好的線組間蛋白條帶輝度基本一致，說明定量較準確。M 1 2
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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1 王國清;食管癌高發(fā)現(xiàn)場早診早治 30年臨床研究經(jīng)驗[J];中國醫(yī)學科學院學報;2001年01期

本文編號：2577881