【摘要】：目的:結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)為全球范圍內(nèi)高發(fā)癌癥,其發(fā)病率排第三位,致死率第四位,而確診時大多為結(jié)直腸癌晚期,嚴(yán)重影響患者的治療效果和生存質(zhì)量。所以為了人類的健康,強調(diào)結(jié)直腸癌的早期篩查與治療。因此,探究在還未形成結(jié)直腸癌的癌前階段是否已有相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的改變,來預(yù)測結(jié)直腸癌的發(fā)生,具有重要意義。異常隱窩灶(aberrant crypt foci,ACF)已被證實是1,2-二甲基肼(DMH)誘導(dǎo)大鼠形成結(jié)直腸癌的一種癌前病變,且先于腺瘤發(fā)生,并遵循結(jié)直腸癌發(fā)展的腺瘤-腺癌途徑。而最近幾年研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能的改變與人體健康受損和疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。因此我們探究致癌劑誘導(dǎo)SD大鼠在結(jié)腸內(nèi)癌前病變ACF形成時,腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝變化是否已有變化,而作為一生物學(xué)指標(biāo)以篩查健康人群和具有結(jié)直腸癌發(fā)生潛能的患者。方法:1.樣本收集:將42只4周齡SD大鼠適應(yīng)1周后隨機分為兩組,實驗組為30只,對照組為12只。實驗組大鼠每周頸背部注射一次DMH,連續(xù)注射2周,同時對照組注射相應(yīng)體積的空白緩沖液。于造模后每隔1周收集所有大鼠的血液(1 ml)及糞便樣本(3~4粒,約1 g),并同時隨機處死4只大鼠(實驗組3只,對照組1只),直至造模后17周處死剩余全部大鼠。2.實驗檢測:⑴ACF的觀察計數(shù):處死大鼠后,游離全段結(jié)腸腸管,粘膜面用0.2%亞甲藍染色,光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸內(nèi)acf數(shù)量的變化,以及行石蠟切片he染色觀察acf中腸上皮細胞的異型性改變。⑵收集到的血液樣本離心后(3000rpm,10min),行血清elisa檢測il-6、il-8及tnf-α濃度。⑶糞便菌群檢測:糞便dna提取試劑盒提取糞便樣本中的dna,并對提取的dna的16srrnav4區(qū)行pcr擴增,擴增純化后的產(chǎn)物于用illuminamiseq平臺測序檢測糞便菌群結(jié)構(gòu)及代謝變化。菌群結(jié)構(gòu)檢測包括菌群alpha多樣性和beta多樣性分析,最終得出實驗組和對照組中有顯著變化的菌群;菌群代謝功能分析使用picrust軟件,根據(jù)kegg數(shù)據(jù)庫中微生物代謝功能的類別對樣本進行檢測。結(jié)果:1.隨著致癌劑dmh造模后時間的延長,實驗組大鼠acf數(shù)目逐漸增加。造模后第1周acf數(shù)為0,第3周acf數(shù)為4.7±1.5個,第5周34.3±6.0個,第7周67.7±11.5個,第9周68.3±12.7個,第11周100.7±33.3個,第13周為114.0±24.3個,第15周為117.0±14.5個,第17周為122.2±25.7個。第3周時每個acf的隱窩數(shù)由1、2個組成,第5周到第17周acf隱窩數(shù)增加為3~5個。從造模后第3周開始,石蠟切片he染色示acf中的腸上皮細胞伴有增生及異型性增生狀態(tài)。2.在結(jié)直腸癌癌前病變的acf時期,隨著dmh造模后時間的的延長,sd大鼠血清內(nèi)促炎細胞因子il-6、il-8及tnf-α濃度隨著造模后時間的延長逐漸增加。除造模后第1周外,余8個時間點所觀察到的實驗組il-6、il-8及tnf-α濃度均高于對照組(p0.05)。3.在結(jié)直腸癌的癌前病變acf期,由beta多樣性分析顯示,造模后第1周兩組間細胞菌群結(jié)構(gòu)無顯著變化,造模后第5周、9周、13周及第17周均出現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)的改變。隨著DMH造模后時間的延長,兩組間結(jié)構(gòu)差異越來越大。使用Metastats統(tǒng)計學(xué)方法對同一時間兩組樣本分析,得到在造模后第9周實驗組中擬桿菌屬豐度增加(P=0.0 18);第17周實驗組乳桿菌菌屬豐度減少(P=0.004)。4.在結(jié)直腸癌癌前病變的ACF時期,PICRUSt軟件分析菌群代謝功能變化結(jié)果為:造模后第1周、5周、9周、13周兩組間菌群功能代謝無顯著變化,造模后第17周實驗組碳水化合物代謝功能下降,而氨基酸代謝功能上升。結(jié)論:1.致癌劑DMH誘導(dǎo)SD大鼠腸道內(nèi)發(fā)生極早癌前病變ACF,尚未對其健康狀態(tài)造成明顯影響,腸道菌群就已經(jīng)發(fā)生了顯著改變。因此腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化和代謝功能改變可作為一項重要的生物學(xué)指標(biāo),用于預(yù)測結(jié)直腸癌的癌前病變。2.癌前病變ACF時期,致炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的升高,提示炎癥可能參與結(jié)直腸癌早期癌前病變的形成。
【圖文】：

導(dǎo)形成的 ACF（紅色箭頭），顯示 ACF 由兩個腔口隱窩組成（亞甲藍染色）。H induced ACF (red arrow), showed that ACF consistshyperchromatic crypts（methylene blue staining）.

- 24 -圖 2 ACF 中腸上皮細胞的增生和異型性增生。A：正常腸上皮；B：造模后 5周，ACF 中腸上皮增生；C：造模后 9 周，，ACF 腸上皮異性增生。（HE×200）Figure2 Hyperplastic and dysplasia intestinal epithelial cells ofACF.A:Normalintestinal epithelium;B:the fifth week after the DMH injected, hyperplastic intestinalepithelial cells ofACF;C:the ninth week after the DMH injected, dysplasia intestinalepithelial cells ofACF.(HE×200)
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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