【摘要】：胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,大量患者死于術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。胃癌的預(yù)后很差,但早期胃癌術(shù)后的五年生存率可高達95%以上。要提高胃癌的治愈率和五年生存率,重在早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷。腫瘤發(fā)生的早期階段,就有核酸釋放入血,外周血循環(huán)腫瘤核酸中可檢測到與腫瘤細胞一致的基因突變。外周血循環(huán)核酸包含循環(huán)DNA和循環(huán)RNA,循環(huán)DNA甲基化以及microRNA (miRNA)標志物已成為腫瘤標志物研究的熱點,血清腫瘤標志物檢測具有無創(chuàng)和易標準化等特點,為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的研究方向和領(lǐng)域�；騿魏塑账岫鄳B(tài)性(single-nucleotide polymorphism, SNP)與胃癌的高發(fā)風(fēng)險有顯著的相關(guān)性,為胃癌高危人群的預(yù)警以及早期診斷提供了科學(xué)依據(jù)。因此對外周血中胃癌相關(guān)腫瘤標志物進行聯(lián)合檢測,是對胃癌實現(xiàn)早期診斷的有效措施,對改善胃癌預(yù)后也有著重要意義。隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles, MNPs)因其具有高比表面積和易分離等特點,已被廣泛應(yīng)用于各種生物分子的檢測。本研究借助MNPs,通過對外周血進行循環(huán)核酸DNA異常甲基化和miR-21相對表達進行檢測,并結(jié)合胃癌相關(guān)基因SNP研究,以便為胃癌的風(fēng)險預(yù)測及早期診斷提供信息。在課題組研究基礎(chǔ)上,最后還探索了一種基于Pd納米顆粒的SNP分型技術(shù)。具體研究內(nèi)容如下：1、基于磁分離的血漿循環(huán)DNA提取及甲基化檢測應(yīng)用MNPs可特異地將分離技術(shù)和富集技術(shù)有機地結(jié)合為一體,大大地提高了DNA提取效率,具有傳統(tǒng)DNA提取方法無法比擬的優(yōu)勢。由于循環(huán)DNA在血漿中含量很少,提取質(zhì)量直接影響到接下來的檢測工作。因此我們選用合適的MNPs來提取血漿中循環(huán)DNA,并檢測了胃癌相關(guān)E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化,然后分析了患者臨床病理特性與甲基化狀態(tài)的關(guān)系。結(jié)果表明：胃癌患者中發(fā)生E-cadherin異常甲基化的比例高于正常對照,低分化與中低分化胃癌患者的異常甲基化比例顯著高于中分化患者(P0.05),潰瘍型胃癌的異常甲基化檢出率與非潰瘍型存在顯著差異(P0.05)。因此,檢測腫瘤患者外周血中循環(huán)DNA特異性改變可為腫瘤的早期診斷及病情監(jiān)控提供新的手段,并有可能為腫瘤的治療、術(shù)后監(jiān)測及預(yù)后的判斷提供重要依據(jù)。2、基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的循環(huán)miR-21檢測近幾年來研究發(fā)現(xiàn),某些miRNA具有類似于癌基因或抑癌基因的作用,miRNA幾乎參與了胃癌發(fā)生與發(fā)展全過程,因此對于未來早期胃癌的篩查、診斷和治療等方面,miRNA的應(yīng)用有巨大潛力。研究表明,miR-21能促進細胞增殖誘發(fā)胃癌,為此,我們建立了MNPs和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合的胃癌miR-21定量技術(shù),檢測了胃癌外周血標本中的miR-21相對表達量(miR-16作為內(nèi)參進行校正),相對于正常對照組,miR-21在胃癌患者血清中的表達水平明顯高于在正常個體血清中的表達水平,這種方法為胃癌的早期快速檢測奠定了基礎(chǔ)。3、基于磁分離和基因芯片技術(shù)的胃癌多態(tài)性研究本研究應(yīng)用基于磁分離和雙色熒光微陣列SNP分型方法,對118例蘇北地區(qū)胃癌患者和120例正常對照進行了COX-2-765GC和BCL-2-938CA位點分型,探索其SNP位點與胃癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系,并進行多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究,具體分析COX-2基因-765GC位點與BCL-2基因-938CA位點在胃癌發(fā)病風(fēng)險中的交互作用。結(jié)果表明,COX-2-765GC位點在胃癌病例組中,59.3%為野生型,33.1%為雜合型和7.6%為突變型；在正常對照組中72.5%為野生型,23.3%為雜合型和4.2%為突變型。BCL-2基因-938CA位點在胃癌病例組中,51.7%為野生型,44.1%為雜合型和4.2%為突變型；在正常對照組中分別為38.3%為野生型,51.7%為雜合型和10%為突變型。COX-2-765GC+CC基因型的個體在胃癌組中顯著增高(OR=1.808,95%CI:1.050～3.113, P0.05),-765C等位基因與蘇北地區(qū)人群胃癌易感性增高相關(guān)(OR=1.701,95%CI:0.840～3.446,P0.05)。BCL-2-938CC基因型的個體患胃癌的風(fēng)險約是AA基因型個體的3倍,-938C等位基因在胃癌患者中檢出率明顯高于正常對照(73.7% vs 64.2%,P0.05),是胃癌發(fā)病的風(fēng)險因素。深入研究表明：COX-2-765CC/GC分別與BCL-2-938CC基因型在胃癌的發(fā)病風(fēng)險中存在著明顯的加乘交互效應(yīng),與COX-2-765GG和BCL-2-938AA基因型攜帶者相比,其胃癌的發(fā)病風(fēng)險分別增高10倍和5倍(OR=10,95%CI:1.280～78.117, P＜0.05; OR=4.667,95%CI:1.137～19.154, P0.05),統(tǒng)計學(xué)差異顯著,說明COX-2基因和BCL-2基因在胃癌的發(fā)生中有明顯的協(xié)同作用。4、基于Pd納米顆粒的SNP分型方法初探Pd納米顆粒作為一種重要的貴金屬,具有良好的催化活性,但是至今為止,以Pd納米顆粒為標記物檢測DNA的相關(guān)報道很少,Pd納米顆粒標記物相對于其它標記方法有很多優(yōu)勢：相對于Au等材料,Pd的價格低,能降低檢測成本；相對于熒光分子標記物,Pd納米顆粒更穩(wěn)定,便于在光照條件下操作；相對于磁性納米顆粒標記物,Pd納米顆粒標記物催化Co或Ni后,不但可以檢測磁性信號,應(yīng)用于定量檢測,而且可以放大檢測信號,降低檢測限,提高檢測的靈敏度。為此,我們探索了一種基于Pd納米顆粒的SNP分型方法,首先基于原位合成法制備了MUA@Pd納米顆粒,成功連接上DNA進行DNA標記；然后用“三明治”雜交體系進行SNP分型,最后用“Pd標Ag染”的方法催化放大檢測DNA信號。我們應(yīng)用此方法對胃癌標本進行COX-2啟動子區(qū)-765GC多態(tài)位點的分型,臨床樣本分型的所有結(jié)果均與直接測序結(jié)果一致。
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作為癌基因或抑癌基因在腫瘤形成、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重耍的角色１４＾２＾研逡逑究發(fā)孤ｍｉ民ＮＡ通過特異性識別靴ｍＲＮＡ的３’非翻譯區(qū)（３＇ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ邋ｒｅｇｉｏｎ，３＇ＵＴＲｓ）［＂］，逡逑在ＲＩＳＣ中的內(nèi)切酶的催化下與ｍ化ＩＳＣ結(jié)合，從而抑制鉛ｍＲＮＡ的翻譯（圖１．３）。人類逡逑基因組中大于３０％的基因在表達過程中受到ｍｉＲＮＡ調(diào)控，當(dāng)ｍ瓜ＮＡ的這種調(diào)控素甜，，將逡逑導(dǎo)致疾病的發(fā)生；另一方面，ｍｉＲＮＡ的調(diào)控影響人體免疫功能，間接導(dǎo)致疾病的發(fā)生：某逡逑些致病因素（如幽口螺旋桿菌）能影響ｍｉＲＮＡ的調(diào)控導(dǎo)致疾病的更進一步發(fā)展Ｉ４４’４５］ｎｍｉＲＮＡｓ逡逑可Ｗ穩(wěn)定地存在于血清和血漿等多種體液中的，其表達譜和癌癥緊密聯(lián)系并且可Ｗ作為腫瘤逡逑早期診斷、分型和預(yù)后判斷的生物標志分子１Ｗ。逡逑Ｍｅｅｈａｎ邋知ｎｓｏｆｍ邋巧邋ＮＡ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ邐＞邐Ｃａｐ逡逑ＡＡＡＡＡＡ邐＾－－－３．邐Ｓｔａｒｔ逡逑灥邋Ａ邐■巧》邐，邐ｓｔｏｐ逡逑產(chǎn)一＊心？姑＾邋ＡＭＡＡＡ邐：n佩危礤邇懾澹危繡義峽坼澹鰨澹翦逯藎澹悖簦簀澹錚鑠澹簦潁幔睿螅椋簦椋錚鑠澹危苠澹椋睿洌椋潁澹悖翦澹澹媯媯澹悖簦簀危遘板澹恚猓錚鰨恚邋義希傘㈠澹桑睿瑁椋猓椋簦椋錚鑠澹錚駑澹椋睿椋簦椋幔簦椋錚鑠澹危苠澹苠澹錚鑠迮洛澹睿螅椋幔簦椋錚鑠�，辶x锨懾巍�、－逦＼邋Ｄ护ａｄｅｎｙe幔簦椋錚鑠危鈴義希校潁澹恚幔簦酰潁邋澹潁椋猓錚螅錚恚邋澹洌潁錚皰澹錚媯駑�、逦＂４＊？辶x希苠危櫻澹瘢�？化ｔｉｅP鑠寤櫻睿洌螅簦椋錚鑠義希櫻歟錚鰨澹溴澹錚蟈澹螅酰椋簦澹溴澹澹歟錚睿紓幔簦椋錚鑠危苠危模澹

本文編號：2574882