【摘要】：蛋白質(zhì)去泛素化是指由去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)介導的蛋白質(zhì)泛素化的負向調(diào)節(jié)過程。泛素和去泛素化調(diào)節(jié)的動態(tài)平衡,影響或者調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導、等許多細胞生理病理過程。去泛素化酶通過水解底物蛋白質(zhì)上的泛素鏈調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性,其活性直接影響細胞內(nèi)多種蛋白的周轉(zhuǎn)率、活性、再生以及定位。P5091屬于泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease7,USP7)的噻吩類抑制劑,能高度特異性抑制USP7酶的活性,并且在多發(fā)性骨髓瘤的治療中顯示良好的抗腫瘤效果,對萬珂、多柔比星等耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細胞也具有抑制作用。此外,P5091抑制結(jié)腸直腸癌細胞的增殖和誘導凋亡。然而,P5091在食管鱗癌中的作用及分子機制仍需進一步研究。本文主要通過體外實驗來研究P5091在食管鱗癌中作用及機制,評價P5091對食管鱗癌增殖、凋亡、克隆形成等的作用,進一步利用si RNA技術(shù)沉默靶基因的表達來反向驗證P5091對食管鱗癌細胞的作用,闡明P5091在食管鱗癌細胞中作用的具體分子機制,為食管鱗癌治療的新藥開發(fā)提供理論基礎,為今后P5091應用于臨床食管鱗癌的治療提供理論基礎。方法1.USP7在食管鱗癌中的表達水平檢測:取多株食管鱗癌細胞系和食管癌組織芯片進行USP7蛋白水平的檢測,選取有代表性的細胞系為本實驗所用細胞系:KYSE450、KYSE510、KYSE30。2.藥物濃度篩選:通過ATP依賴的熒光素酶細胞活性檢測來計算在不同細胞系中P5091的IC50值,從而確定不同細胞系的實驗藥物濃度。3.平板克隆形成實驗和細胞形態(tài)學圖片分析:評價不同濃度的P5091對食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖抑制效應。4.細胞凋亡檢測:用AnnexinV-FITC和PI染色檢測不同濃度的P5091對食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE510和KYSE30凋亡的影響。5.Caspasae-3的激活情況:用FITC-DEVD-FMK染色法檢測Caspase-3激活情況;Western Blot檢測P5091作用后食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的c-PARP和c-caspase-3的表達情況。6.P5091對抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的影響:Western Blot檢測P5091作用后食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE510和KYSE30中抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的變化,本實驗中Noxa發(fā)生明顯變化。7.P5091對Noxa m RNA水平的影響:用Q-PCR的實驗方法測定P5091處理食管鱗癌細胞后不同時間點促凋亡蛋白Noxa的m RNA水平變化。8.Noxa在P5091誘導細胞凋亡中的作用:對Noxa基因沉默后通過流式細胞術(shù)來檢測不同濃度P5091引起的食管鱗癌細胞凋亡率的變化。9.轉(zhuǎn)錄因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)上調(diào)Noxa:同時對Noxa和調(diào)節(jié)Noxa基因表達的上游調(diào)控分子ATF4進行基因沉默,通過流式細胞術(shù)檢測不同濃度P5091引起的細胞凋亡率的變化。用Western blot的方法檢測對Noxa、ATF4基因沉默后凋亡標志性蛋白c-PARP蛋白水平的變化。結(jié)果1.P5091抑制食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖ATPlite實驗、平板克隆以及形態(tài)學觀察的實驗結(jié)果顯示,P5091可以明顯抑制食管鱗癌細胞增殖,并且呈濃度依賴性。2.P5091誘導食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE510和KYSE30發(fā)生凋亡流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明不同濃度P5091引起食管鱗癌細胞發(fā)生明顯的凋亡,總凋亡率隨藥物濃度增加而升高。同時Western blot實驗結(jié)果表明:細胞凋亡標志性蛋白c-PARP和c-caspas3的表達增加,并且隨著藥物濃度增加而增高。3.P5091通過促進促凋亡蛋白Noxa的表達來誘導食管鱗癌細胞的凋亡Western Blot結(jié)果顯示,P5091處理后Noxa蛋白水平明顯增高。Q-PCR結(jié)果顯示:P5091處理后在不同的時間點食管鱗癌細胞中Noxa的m RNA水平均有明顯升高。對食管鱗癌細胞進行Noxa基因沉默后,不同濃度P5091引起食管鱗癌細胞的總凋亡率與Noxa基因敲除前相比明顯降低,且c-PARP蛋白水平也明顯降低,提示Noxa可能是P5091作用的關鍵分子。4.P5091誘導食管鱗癌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)Western blot結(jié)果顯示P5091處理后ERS的標志性蛋白p-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明顯增高,提示P5091誘導食管鱗癌細胞發(fā)生ERS。5.P5091通過上調(diào)ATF4,進而引起Noxa積聚,最終誘導細胞凋亡Western blot結(jié)果顯示P5091處理后ATF4和Noxa蛋白水平明顯升高,且流式結(jié)果提示P5091誘導細胞凋亡。同時,Q-PCR結(jié)果提示P5091也上調(diào)了Noxa的m RNA水平。為了進一步探究Noxa是否是受ATF4調(diào)控,我們進行Noxa和ATF4的基因沉默實驗。結(jié)果提示:RNA干擾沉默ATF4后,P5091引起的細胞凋亡率明顯降低,c-PARP和Noxa蛋白水平明顯降低,提示ATF4很可能是P5091引起食管鱗癌細胞凋亡中Noxa積聚的主要調(diào)節(jié)因子。結(jié)論1.P5091顯著抑制食管鱗癌細胞的增殖。2.P5091通過ERS上調(diào)ATF4的表達,促進Noxa的表達,進而引起食管鱗癌細胞凋亡。
【圖文】：

實驗結(jié)果.實驗結(jié)果.1USP7 在食管鱗癌細胞系及組織中的表達情況檢測首先通過免疫印跡和免疫組化的實驗方法檢測食管鱗癌細胞和組織中U白表達水平，初步了解 USP7 在食管鱗癌中的表達情況，也為下一步實驗所胞系的篩選提供依據(jù)。綜合免疫印跡實驗和免疫組化實驗結(jié)果，初步表明食管鱗癌細胞系和癌組織中 USP7 呈普遍表達的情況（圖 1）。此外，免疫實驗結(jié)果我們可以看出，7 種食管鱗癌細胞系中 USP7 的表達水平并不一致可能與食管癌細胞的分化以程度、耐藥等因素有關。因此，，本實驗中，選SP7 不同表達水平的細胞系 KYSE30、KYSE510 和 KYSE450 來進行實驗。

實驗結(jié)果3.2 P5091 抑制食管鱗癌細胞增殖3.2.1ATPlite 實驗：用不同濃度梯度 P5091 分別處理三種食管鱗癌細胞 72h，通過 ATPlite 實驗檢測細胞活力，判斷 P5091 對食管鱗癌細胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，在相同的處理時間條件下，隨著 P5091 濃度的增高，細胞活力降低，即 P5091 對食管鱗癌細胞的增殖抑制作用隨之也增加(與 DMSO 對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，且呈劑量的依賴性。（圖 2）
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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